曾瑞梅 吴亚平

肺炎是儿童较常发生的一种呼吸道感染性疾病，具有发病迅速、易感染等特点，约有10%的患儿可进展为重症肺炎，是7岁以下儿童死亡的一个主要病因［1］。细菌、病毒、支原体、衣原体感染均可能引起小儿肺炎，不同病原体感染诱发的免疫发展方向可能存在较大差异，采取的治疗措施也不同，但患儿早期临床表现可能无明显特异性，仅根据临床表现并不能明确病原体类型，增加了临床对症治疗难度，影响治疗效果［2］。呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）与肺炎衣原体（chlamydia pneumoniae，CP）感染是引起小儿肺炎的常见原因，发病率高但患儿死亡率较低［3］。目前，临床关于细菌性肺炎、支原体肺炎及多种病毒性肺炎的研究较多，但关于RSV和CP感染小儿肺炎的免疫影响比较鲜有报道。因为免疫治疗能够有效降低RSV、CP引发的呼吸道感染发病率，了解RSV和CP感染所致肺炎患儿的外周血淋巴细胞亚群特征，分析两种病原体的免疫反应作用机制，对于发展靶向免疫治疗有着积极意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2020年1月至2020年12月桐庐县第一人民医院收治的肺炎患儿1,000例。（1）纳入标准：年龄≤12岁；符合《诸福棠实用儿科学》［4］中的小儿肺炎诊断标准，有呼吸道感染病史、呼吸道感染症状及体征；胸部X线片可见肺炎影像；病原体检测明确为单一病原体感染，RSV或CP；无其他系统器官感染。（2）排除标准：吸入性肺炎、先天性疾病及湿肺；混合感染；近3个月接受过抗感染治疗者；临床资料不完整。其中，男童584例，女童416例；年龄0.25～11（6.58±4.05）岁；入院时均有发热（≥38.5 ℃）、咳嗽、流涕等症状；RSV感染496例（急性感染299例、慢性感染197例），CP感染504例（急性感染328例、慢性感染176例），病程≤1个月为急性感染，病程＞1个月为慢性感染。另选取同期在本院进行健康体检儿童（性别、年龄相匹配）100例作为对照组。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有研究对象家属均签署知情同意书。

1.2 研究方法 （1）在病程第3～5天采集患儿外周静脉血3 mL，对照组儿童在体检时采集静脉血标本，以3,000 r/min离心10 min，分离血清后使用抗凝真空管保存2份，置于-70 ℃的冰箱中待检。（2）一份血清标本使用CANTO Ⅱ型流式细胞仪（美国BD公司）及淋巴细胞亚群试剂盒测定T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞各表型的百分比，T淋巴细胞表型包括CD3+、CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD4+，计算CD4+/CD8+，B淋巴细胞包括CD3-CD19+，自然杀伤细胞为CD3-CD56/16+。采用比例计算淋巴细胞的绝对计数，计算公式：总淋巴细胞计数×某表型淋巴细胞百分比。（3）另一份血清采用双抗夹心酶联免疫吸附法测定血清转化生长因子β1（TGF-β1）、白细胞介素-17（IL-17）、干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-10（IL-10）水平，试剂盒均由R&D公司提供，操作均严格按照试剂盒说明书进行，在450 nm酶标仪下读取吸光度，并制作标准曲线，计算TGF-β1、IL-17、IFN-γ、IL-10水平。

1.3 观察指标 （1）三组儿童的外周血淋巴细胞亚群（T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞）绝对计数；（2）三组儿童的血清TGF-β1、IL-17、IFN-γ、IL-10水平；（3）急性感染及慢性感染患儿的细胞因子水平。

1.4 统计学方法 采用SPSS 23.0统计软件。计数资料以例数/百分比表示，采用χ2检验。计量资料符合正态分布以（±s）表示，采用方差分析或t检验；不符合正态分布以 ［M（P25，P75）］表示，采用非参数检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组的一般资料比较 三组儿童的性别、年龄、感染程度、感染史比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 RSV感染、CP感染患儿与健康儿童的一般资料比较

2.2 三组的外周血淋巴细胞亚群绝对计数比较 三组的外周血CD3+、CD3+CD8+、CD3-CD19+绝对计数比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。三组的CD3+CD4+、CD4+/CD8+、CD3-CD56/16+绝对计数比较，差异有统计学意义（P＜0.05），组内两两比较显示对照组的CD4+/CD8+绝对计数明显低于RSV组和CP组（P＜0.05），RSV组的CD3+CD4+、CD4+/CD8+绝对计数均比CP组更高，CD3-CD56/16+比CP组更低（P＜0.05），CP组的CD3+CD4+绝对计数与对照组接近（P＞0.05），CD3-CD56/16+高于对照组（P＜0.05）。见表2。

表2 三组的外周血淋巴细胞亚群绝对计数比较［M（P25，P75）］

2.3 三组的血清细胞因子水平比较 三组的血清细胞因子水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。组内两两比较显示，对照组的TGF-β1、IL-17、IFN-γ、IL-10水平均低于另外两组（P＜0.05），RSV组与CP组的血清TGF-β1水平接近（P＞0.05）。RSV组的血清IL-17、IL-10水平比CP组更高，IFN-γ水平比CP组更低（P＜0.05）。见表3。

表3 三组的血清细胞因子水平比较［pg/mL，（±s）］

表3 三组的血清细胞因子水平比较［pg/mL，（±s）］

组别 n TGF-β1 IL-17 IFN-γ IL-10 RSV组 496 63.84±12.01 103.95±33.57 66.25±7.69 68.97±10.84 CP组 504 61.78±9.28 55.24±32.96 112.47±25.58 23.55±6.32对照组 100 30.36±8.69 23.05±13.25 36.77±10.27 16.02±5.27 F值 7.036 13.628 23.658 10.996 P值 0.037 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 急慢性感染患儿的血清细胞因子水平比较 RSV组和CP组急性感染患儿的血清TGF-β1、IL-17、IL-10、IFN-γ水平均高于慢性感染患儿，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表4 急慢性感染患儿的血清细胞因子水平比较［pg/mL，（±s）］

表4 急慢性感染患儿的血清细胞因子水平比较［pg/mL，（±s）］

组别 n TGF-β1 IL-17 IFN-γ IL-10 RSV组 急性 299 74.78±11.95 127.69±23.45 70.36±7.26 75.84±9.22慢性 197 50.21±13.66 85.29±24.64 40.25±6.32 55.21±9.76 t值 13.658 24.669 16.928 20.958 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 CP组 急性 328 66.57±8.42 63.28±18.49 133.54±26.69 31.48±7.25慢性 176 50.04±9.17 48.04±15.97 101.52±24.48 18.27±5.93 t值 16.669 18.054 12.908 9.962 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 讨论

RSV和CP是小儿呼吸道感染的主要病原体。RSV是一种单链RNA病毒，其在感染季节内及感染季节之间可以发生广泛变异，能引起患儿不同程度的肺部感染，病情严重时可造成毛细支气管炎，部分患儿还可能进展为长期慢性气道疾病［5］。虽然最初的RSV仅在鼻咽内复制，但其可逐步传播至下呼吸道引发下呼吸道感染。RSV被证实对Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮细胞均有嗜性，能通过感染肺泡上皮细胞来影响气体交换及肺泡表面活性剂的产生［6］。RSV糖蛋白能够辅助RSV进入细胞，抑制核因子-κb的激活，调节宿主免疫应答，协助病毒逃离中和抗体。临床认为RSV感染引起的肺部疾病严重程度与机体抗病毒T细胞反应密切相关［7］。CP是一种细胞内寄生菌，是人类常见的呼吸道致病菌，常引起鼻窦炎、咽炎、肺炎、支气管炎、支气管哮喘等急性呼吸道感染。另有研究指出，CP的持续性感染还可能增加动脉硬化、急性心肌梗死、盆腔炎等疾病的发生风险［8］。国外的一项调研结果显示，CP在社区获得性肺炎病因中排名第二［9］。

研究显示，CP感染可引起以细胞免疫为主的免疫应答，机体免疫系统主要通过各种免疫应答反应来对病原体的侵袭进行防御，其中体液免疫利用血清抗体发挥防御作用，细胞免疫则能有效清除病原体。各种免疫应答途径会让机体的淋巴细胞亚群呈现不同变化，而儿童对感染的免疫反应通常要比成人更为活跃。在机体受到病原体侵袭时，T细胞会收到来自于抗原提呈细胞呈递的外源性抗原肽，T淋巴细胞被激活后，CD4+T淋巴细胞会促进T细胞向效应细胞转化，并释放活性物质增加B细胞和巨噬细胞的活性，进而引发免疫损伤［10］。CD8+T细胞活化后会产生细胞毒性，其在脱颗粒作用下释放颗粒酶B、穿孔素，从而对靶细胞造成损伤。本研究显示，RSV组和CP组的CD4+/CD8+绝对计数较健康对照组增高，表明不论是RSV感染还是CP感染均会引起不同程度的免疫功能紊乱，具体表现为CD8+T细胞减少。本研究中RSV感染与CP感染患儿比较，RSV组的外周血CD3+CD4+、CD4+/CD8+绝对计数更高，CD3-CD56/16+百分比更低。有研究指出，不论病原体是病毒还是细菌，均会造成外周血CD3+、CD8+T淋巴细胞减少，CD4+/CD8+T淋巴细胞升高［11］，因为患儿的肺部受到病原体感染后发生免疫功能失调，机体对抗原的杀伤力减弱，体液免疫水平下调，所以不能有效地将病原菌清除体外。RSV与CP感染引起的外周血淋巴细胞亚群变化存在差异，与国内相关报道结论有类似之处［12］。本研究结果显示，相较于RSV感染，CP组NK细胞百分比更高。NK细胞参与机体的固有免疫，会对病原体和被感染细胞产生直接的杀伤作用，并且还能通过促进IFN-γ的分泌来调节细胞免疫，NK细胞减少可造成IFN-γ分泌减少，造成Th1/Th2免疫失衡。进一步的血清细胞因子检测发现，CP组的血清IFN-γ水平高于RSV组，可能是因为CP是一种细胞内细菌，感染单核细胞、巨噬细胞引发的特异性细胞免疫反应表现为淋巴细胞增殖、IFN-γ分泌。研究证实，CP感染能够减少继发感染，因为该免疫过程是由CD4+T细胞反应所介导，而CD4+T细胞识别的抗原能够在随后的感染中发挥保护作用［13］。IL-10为抑制适应性免疫反应的嗜性细胞因子，几乎所有免疫细胞都能表达IL-10的两个亚单位，但主要由CD4+T细胞表达，故免疫细胞较易受到IL-10的抑制作用。临床认为RSV引起的肺部疾病与宿主的适应性免疫反应密切相关，本研究发现RSV组的CD4+T细胞百分比、血清IL-10水平均高于CP组，与国外报道结论相符［14］，表明RSV感染引起的CD4+T细胞反应更为强烈，调节效应T细胞反应使得IL-10分泌增加，IL-10可对T细胞介导的肺部炎症及损伤发挥抑制作用，其在调节RSV的适应性免疫反应中发挥着重要作用。

特异性的CD4+T细胞能够识别CP抗原，主要利用CD4+细胞分泌的IFN-γ对CP抗原发挥溶解作用，Th2细胞无法控制CP感染一方面与IFN-γ的缺乏有关，另一方面则与Th2细胞无法攻击受感染细胞有关。CP感染引起的免疫反应以Th2反应为主导，而IFN-γ、IL-10等细胞因子均参与Th1/Th2平衡调节。本研究通过比较不同感染程度患儿的血清细胞因子水平发现，急性感染者的血清TGF-β1、IL-17、IL-10、IFN-γ水平明显更高，与相关文献报道结论相符［15］，说明不论是RSV还是PC感染引起的小儿肺炎，急性发病引起的适应性免疫反应更为明显，并且这种免疫反应会随着时间的推移而减弱。

综上所述，RSV和CP感染引起的外周血淋巴细胞亚群变化存在一定差异，二者分别主要通过调节IL-10和IFN-γ表达来影响CD4+T细胞亚群，引起细胞免疫异常，通过检测外周血淋巴细胞亚群及相关血清细胞因子可为临床判定小儿肺炎感染类型提供一定依据。