周瑞静 田港 陈颖君 郭沅琪 周泓宇 俞薇 单琪媛 郑平汉

山茱萸为山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果肉，具有补益肝肾、涩精固脱的作用［1］。现代药理研究显示，山茱萸的主要成分有环烯醚萜类、黄酮、有机酸类等［2-3］，而环烯醚萜类的含量相对较高，其中含量较高的是莫诺苷和马钱苷，能够缓解骨性关节炎、调节免疫、缓解神经痛等［4-8］。品种、种植环境及气候条件等因素均可影响山茱萸药材有效成分的物质积累差异，进而产生临床疗效和经济价值的差别［9］。河南、陕西为山茱萸目前最大的产区，浙江临岐有较丰富的野生山茱萸资源。野生因素、产地、品种对山茱萸成分含量的影响尚无报道。本文采用超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC）指纹图谱［10］比较不同产地与浙江野生山茱萸不同品种整体特征，并定量分析没食子酸、莫诺苷、马钱苷等三种指标成分，以期为浙产道地药材山茱萸的野生资源保护、山茱萸优种优育与药材质量提升提供参考，为临床药效保障提供基础支持。

1 材料与方法

1.1 仪器设备 ACQUITY UPLC H-Class Plus系列超高效液相色谱仪（美国Waters公司），BSA124S电子天平（0.1 mg，sartorius，Germany），SQP电子天平（0.01 mg，sartorius，Germany），KQ-500DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 材料及试剂 没食子酸（成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-19032801），莫诺苷（乐美天医药，德思特生物，批号：DST200303-039），马钱苷（成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-18080704），磷酸、甲醇、乙腈为色谱纯，水（超纯水，Unique-S*型多功能超纯水系统，锐思捷水纯化技术有限公司）。山茱萸的采购、产地及批次信息，见表1，并经由浙江中医药大学秦路平教授鉴定。

表1 山茱萸的产地及批次信息

1.3 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC® BEH C18（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm）。流动相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱程序见表2，流速为0.3 mL/min，检测波长为254 nm，柱温为30 ℃，进样量为0.5 μL。混合对照品溶液及山茱萸样品溶液的色谱图，见图1。

图1 混合对照品溶液（A）及山茱萸供试品溶液（B）的UPLC色谱图

1.4 混合对照品溶液的制备 精密称取马钱苷、莫诺苷、没食子酸对照品适量，置10 mL容量瓶中，加体积分数为80%甲醇溶解定容，分别制成浓度为30、200、120μg/mL的对照品溶液。

1.5 山茱萸供试品溶液的制备 精密称取过3号筛的山茱萸粉末0.200 g，置25 mL锥形瓶中，加体积分数80%甲醇溶液定容至刻度，称重，超声提取（功率300 W，频率40 kHz）45 min，取出，再称重，补足丢失的质量，取上清液过0.22 μm微孔滤膜作供试液。

1.6 方法学考察 （1）线性关系考察：取对照品溶液，用体积分数为80%的甲醇溶液逐级稀释，制备7个浓度梯度的混合对照品溶液，按色谱条件进样测定。（2）精密度试验：取山茱萸（S4）供试品，按色谱条件连续进样6次。（3）重复性试验：取同一批山茱萸（S4）供试品6份，制备供试品溶液，按色谱条件进样测定。（4）稳定性试验：取山茱萸供试品溶液，按色谱条件分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样测定。（5）加样回收率试验：取同一批山茱萸供试品（S7）6份，分别精密加入等量的各对照品，制备供试品溶液，按色谱条件进样测定。

1.7 样品含量测定 取12批山茱萸样品制备山茱萸供试品溶液，按色谱条件进样测定。

1.8 指纹图谱的建立 将12个不同产地、批次的山茱萸UPLC图谱以CDF格式导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012.130723版本），将S1号批次（浙江省杭州市淳安县临岐镇审丰村2019年采收）谱图作为对照谱图，采用中位数法，产生参照图谱，以多点校正法对各个色谱峰的保留时间进行校正，校正的mark峰选择没食子酸、莫诺苷、马钱苷3个共有峰。

1.9 聚类分析 相似度计算结果应用SPSS软件，参数设置为欧式距离，采用ward聚类方法计算。

2 结果

2.1 山茱萸中三种成分线性关系考察结果 三种成分在相应的浓度范围内与峰面积的线性关系良好，以对照品溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制线性方程，见表3。

表3 山茱萸中三种成分线性关系考察结果

2.2 方法学考察的精密度、重复性及稳定性试验结果 以对照品溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制线性方程，精密度试验计算得到马钱苷、莫诺苷、没食子酸峰面积RSD分别为0.90%、1.04%和1.22%，表明仪器精密度良好。重复性试验计算得到马钱苷、莫诺苷和没食子酸峰面积的RSD分别为1.68%、1.54%和2.28%，表明该方法重复性良好。稳定性试验中，计算得到马钱苷、莫诺苷和没食子酸峰面积的RSD分别为1.15%、1.98%和2.92%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3 山茱萸中三种成分加样回收率试验结果 分别根据线性方程计算莫诺苷、马钱苷、没食子酸在精确称量的样品中加入对应标准品后的平均加样回收率，结果见表4。

表4 山茱萸中三种成分加样回收率试验结果

2.4 山茱萸三种成分含量测定结果 根据标准曲线计算12批样品中三种成分的含量，结果见表5。

表5 山茱萸三种成分含量测定结果（±s）

表5 山茱萸三种成分含量测定结果（±s）

编号 没食子酸（mg/g） 莫诺苷（mg/g） 马钱苷（mg/g）S1 0.31±0.01 10.22±0.06 3.11±0.04 S2 0.50±0.00 7.18±0.05 2.61±0.01 S3 0.92±0.02 8.11±0.15 2.65±0.05 S4 1.70±0.03 7.81±0.08 3.46±0.03 S5 0.65±0.01 7.02±0.03 2.35±0.01 S6 0.12±0.01 11.92±0.11 2.27±0.01 S7 0.74±0.00 8.95±0.05 2.17±0.03 S8 0.48±0.01 20.00±0.24 4.90±0.04 S9 1.74±0.01 5.38±0.06 2.37±0.03 S10 1.07±0.00 5.73±0.00 2.48±0.01 S11 0.91±0.02 6.03±0.03 2.45±0.03 S12 1.47±0.01 6.72±0.08 3.09±0.01

2.5 指纹图谱 见图2。

图2 不同产地山茱萸的指纹图谱

2.6 不同产地山茱萸指纹图谱相似度分析 结果显示，在不同产地、批次的山茱萸指纹图谱之间存在着较高的相似度，但具体相似程度在不同批次之间也存在一些差异，与对照批次相比，S3（淳安瑶山天坪）相似度较高，在0.990以上，S9（杭州临安）相似度较低，为0.821，其余批次谱图相似度在0.961～0.986之间。见表6。

表6 不同产地山茱萸指纹图谱相似度计算结果

2.7 聚类分析结果 见图3。结果表明，产地、品种、采收时间对于山茱萸指纹图谱的相似度都有影响。S6、S7、S8三者为一类，对照批次信息可知三个批次产地均为临岐，且采收时间相近，其中S6、S8两者更为接近，对照信息两者都为临岐兰林坑采收，而S7为棉花湾采收，说明同一个镇的不同地理位置对于山茱萸的品质也有影响，原因可能为种植的土壤条件、海拔高度等产生的差异。S2、S5、S3、S1聚为一类，四个批次产地均为淳安县，说明淳安县产地的山茱萸的有效成分较为相似。S10、S11、S12、S4聚为一类，这四个批次的产地为河南省和陕西省，说明两个省份的山茱萸品质较为相近。S9（杭州市临安区）与其他类别相差较远，原因可能为临安产山茱萸的品种不同或是土壤种植条件、气候等因素与其他地区存在较大的差异。

图3 不同产地山茱萸聚类分析图

3 讨论

山茱萸的临床应用广泛，是治疗糖尿病、冠心病以及高血压的常用药，中成药六味地黄丸、金匮肾气丸及杞菊地黄丸中都用其作配伍，具有收敛固涩、补肝益气、熄风止痉等功效。现代研究表明，山茱萸主要有免疫调节、降血糖、抗衰老、抗氧化、肾脏保护等作用，其发挥临床药理作用的主要是环烯醚萜及其苷、三萜及多糖类、有机酸等［2］。该研究测定山茱萸中没食子酸、莫诺苷和马钱苷三种指标成分，也是其主要药理活性成分，具有较高的临床药用价值。

指纹图谱聚类分析能够明确区分出浙产山茱萸与其他产区山茱萸药材，还能区分出野生药材和栽培品种。浙江省杭州市淳安县山茱萸总体主要有效成分含量较河南、陕西产区高，其中S1、S2、S3、S5为淳安县山茱萸栽培品种，S6、S7、S8为临岐山茱萸野生品种。产地、品种等因素对山茱萸主要药理指标成分莫诺苷含量影响较大，对马钱苷、没食子酸含量影响波动较小。不同产地与品种的山茱萸样品中，没食子酸、莫诺苷、马钱苷的含量范围分别在0.1220～1.7373 mg/g，5.3753～19.9978 mg/g，2.1691～4.9048 mg/g。临岐镇的山茱萸（石磙枣、正青头枣）莫诺苷含量较其他产地高，其中以S8野生山茱萸品种石磙枣的莫诺苷含量最高，约为河南、陕西产区栽培品种的2倍，表明临岐道地产区的野生山茱萸种质资源具有一定质量优势。S9（杭州市临安区）和S10（陕西省丹凤县）的莫诺苷含量在12批次中较低，可能是产地与品种的不同导致的差异，也可能是因为购买年份较久，有效成分在贮存的过程中发生不同程度的损耗。山茱萸树种间，品种、产量、果型、果实成熟时间、有效成分含量差异明显，可结合品种、种植因素等多方面考察、基因转录水平的有效成分积累调控，充分利用优质野生品种进行优选优育。

综上所述，采用UPLC指纹图谱法同时测定不同产地山茱萸中没食子酸、莫诺苷和马钱苷三种成分，方法简单，操作性和重复性较好，可为山茱萸药材种质资源保护、优种优育提供科学依据，为临床药效保障提供基础支持。同时，山茱萸所含的有效成分各有其不同的作用，需要进一步分离其有效成分并开展药理研究，以便更广泛的应用于临床。