杨玉洁

【摘要】近年来，培养组学的发展使得可培养的人体细菌库剧增，人们对宿主-细菌之间相互作用关系的认知进一步加深。培养组学在动物医学中的应用使可培养的细菌大量增加，在临床致病菌分离鉴定中发现了新的分类群，且减少了在宏基因组学研究中的尚未明确分配的操作分类单元。本篇综述在介绍培养组学研究方法的同时，重点介绍培养组学新技术在动物医学领域的应用现状，并展望其未来的发展趋势。

【关键词】培养组学;微生物菌群;动物医学

1培养组学在反刍动物瘤胃微生物研究中的应用

1.1瘤胃微生物纯培养技术

Hungate滚管技术以及手套厌氧培养箱已广泛应用于厌氧微生物的分离培养。由于不同的微生物对生长环境和特殊偏好营养物的需求各异，研究者可据此设计不同的培养方案对其进行筛选、分离、鉴定、纯培养。培养和筛选过程中，可以通过调整生长环境参数（如培养基酸碱度、营养因子等）抑制杂菌生长，从而减少杂菌对目标微生物增殖的影响。主要的操作方法为在厌氧室内取部分瘤胃内容物样品，厌氧环境：50mL·L-1H、200mL·L-1HCO2、750L·L-1H采用0.22μm滤膜过滤后的1×厌氧磷酸盐缓冲液，以10倍稀释法将样品从原液稀释至10-6浓度。每块培养基分别接种100μL不同浓度的样品混合液，在厌氧室内39℃培养3d。作为空白对照，每种培养基类型取2个培养基，不进行接种，与其他培养基一起孵育。此外，取适量用于稀释瘤胃样品的缓冲液，接种至培养基作参照。上述培养结束后，取1mL无菌无氧的8.5g·L-1NaCL溶液均匀刮洗平板，用吸管收集该平板上所有的微生物，以备后续鉴定。以现有的微生物培养方法为基础，不断地改进培养设备，综合并优化各项培养条件/方式，可以更好地对目标微生物进行体外纯培养。

1.2培养基类型、样品稀释度和系统发育与瘤胃微生物可培性的关系

反芻动物瘤胃微生物群的培养是瘤胃微生物培养组学研究的重要内容之一。随着瘤胃微生态系统研究技术的进一步发展，反刍动物消化系统微生物功能得以深入研究。计算机科学与自然生命科学的交叉融合，使得组学技术在诠释瘤胃微生物的组成功能及代谢特征中作用凸显，尤其是在瘤胃微生物资源研究中，培养组学的重要性不言而喻。在瘤胃微生物培养组学研究中找出该系统生境中可被培养的部分以及各种影响其可培性的因素十分重要。采集样品的稀释度与实验过程中使用的各种类型的培养基都会影响瘤胃微生物的可培性，说明在体外重建瘤胃微生物系统仍需要大量细致的培养条件试验和探索。研究人员通过培养组学发现瘤胃微生物的复杂性及其功能谱系远超预期。因此，通过对瘤胃微生物区系进行体外重建，以深入了解其生态/生物功能，对开发应用瘤胃微生物资源具有重要意义。

2培养组学在人体肠道微生物研究中的应用

2.1可培养细菌数据库的增加

近10年，随着宏基因组学在微生物研究中的应用，人类对肠道微生物区系的认识似乎已经到了平台期，随着培养组学的发展，肠道中的一些“暗物质”逐渐被揭开。一些通过分子手段鉴定不到的“Unclassified”逐渐被培养鉴定，不断有新培养得到的细菌基因组数据被收入人类肠道细菌数据库。据统计，截至2018年，通过培养方式首次分离得到的菌种已经由2015年统计的2172种增加到2776种，所增加的604种细菌中，有372种分离自肠道。研究人员在2012年首次采用培养组学分离鉴定到174个以前在人类肠道中从未培养过的细菌，并对其中31个新细菌的基因组测序，产生了约1万个新的未知基因，这不仅扩充了细菌数据库，同时有助于细菌基因功能的深入发掘。该团队从2012年到2015年共发现新种121种，其中有91种是通过培养得到，占比达75%。假设细菌与最接近它的标准菌株的相似性小于98.65%则被定义为疑似新种，那么使用培养方法每周就能确定1～25个疑似新种。到2017年，该团队共从人体中分离培养出329个新细菌，使已知的人类细菌库增加了29%，且首次从人体内分离到4种古生菌，其中包括2个新菌种。通过培养组学增加人类微生物资源库，有助于研究人员从发现的新细菌中开发安全有效的适用于人体的益生菌。可培养参考基因组数量的增加很大程度依赖于高通量的微生物培养，增加的数量越多使测序获得的基因序列与数据库比对的速度越快，同时也提高了对人体肠道微生物基因组的分辨率，进而能更加准确剖析单个菌株的基因功能。可培养基因组参考集的建立，极大的推动了基因组学在肠道微生物中的应用。

2.2与人体肠道细菌疗法

相关菌群的培养结合宏基因组分析结果，目前发现的一些可能涉及到定植、急性或慢性感染的微生物被培养的比例很低。虽然测序能认识到复杂的肠道微生态，却不能明确微生物在宿主中发挥作用的机制，也无法拿到单菌株做验证试验。培养组学通过培养健康与患病个体肠道中的差异生物标志物，获得细菌活体样本，进而深入剖析细菌与疾病之间的内在联系机制。肠道微生物区系的一个主要功能是提供抗定殖能力，其中病原体细菌被抑制或控制在感染水平以下。粪菌移植（FMT）已被广泛用于治疗由于致病或条件致病微生物过多而引起的胃肠道疾病，如克罗恩病、溃疡性结肠炎等。这得益于脑肠轴的发现，FMT还被证实可以有效缓解自闭症[38]。而目前此方法仍存在很多问题，粪便捐献者在捐赠粪便过程中可能将自身一些潜在致病菌传染给被移植者，这是治疗中很难避免的问题。一些肠道细菌与结直肠癌或肥胖相关，据报道，FMT治疗后患者体重指数无故增加了8.5个点。人们希望确切地知道在治疗过程中具体有哪些细菌被转移给了患者。通过培养组学可以获得健康人与患者肠道的关键差异细菌群，服用混合菌的方式有效避免了患者受捐赠者带来的潜在致病菌的影响。

结束语：

总的来说，除了培养组学此前的贡献外，培养组学以及其他微生物体外纯化培养的方法都将促进兽医微生物研究领域的扩展进程，这些研究带来的应用价值十分深远。

参考文献：

刘钢，强直性脊柱炎肠道微生物菌群分析及干预研究.天津市，天津市天津医院，2020-12-30.

彭娜，彭先启，乐敏.微生物菌群培养组学在动物医学中的应用[J].畜牧兽医学报，2020，51（12）：2942-2953.