段政勇，邢 志，王海岗，陈 凌，Dipak K Santra ，王瑞云，，乔治军，

（1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学 农业基因资源研究中心/农业农村部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室/杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室，山西 太原 030031；3.内布拉斯加大学林肯分校农艺系小宗粮豆研究与推广中心，美国 内布拉斯加州 69361）

黍稷（Panicum miliaceumL.）属于禾本科黍属，又名糜黍、糜子。黍稷栽培历史可以追溯到1万年以前，是我国北方的主栽作物[1]，在欧亚大陆的许多干旱地区均有分布[2]。黍稷具有生长周期短、抗盐抗旱、耐贫瘠的特性，蕴含着丰富的抗逆基因，一般在温暖的季节生长、成熟、结实，并能够充分利用水资源，是旱地半干旱地栽培的主要农作物[3-4]。黍稷营养丰富，淀粉、高膳食纤维、蛋白质以及多种维生素为其主要组成部分，对人体有着较高的营养价值，黍稷还含有丰富的矿质元素、多酚、黄酮等，能够降血糖、增强人体机制、预防多种疾病[5-7]。黍稷生态适应性强[8]，分布广泛，种质资源种类繁多，基因组信息多样，针对黍稷抗旱、耐高温及蒸腾速率低等优良特性进行遗传多样性评价和遗传背景分析，有助于对抗旱、保水等基因资源的挖掘和高效利用[9]，也有助于黍稷品种资源的鉴定、选育、改良。

利用分子标记开展作物遗传多样性分析是作物种质资源遗传背景研究的重要手段，微卫星标记作为重要的遗传标记之一[10]，可以有效鉴别基因型，目前被广泛用于构建指纹图谱[11]、评估作物遗传多样性[12]以及鉴定品种等方面[13-14]。随着微卫星标记迅速发展，利用其对黍稷遗传背景研究已经成为主流方式。HU等[15]最先利用种间SSR标记分析了我国糜子的遗传差异特性。2010年，CHO等[16]首次构建了25个黍稷微卫星标记，并针对50份供试材料分析黍稷资源遗传多样性与遗传结构。石甜甜等[17]用144个SSR标记评估国内外5个生态区黍稷材料的遗传差异性，并对基础数据做了综合分析，发现北方春糜子区的遗传多样性更为丰富，为北方春糜子区黍稷材料的遗传研究和遗传育种指出了方向。HUNT等[18]利用16个微卫星位点成功将欧亚大陆98个地方品种的遗传多样性进行分析，探讨了黍稷在欧亚大陆范围内的系统地理结构。RAJPUT等[14]运用比较基因组学发展了来源于柳枝稷基因组的SSR标记，检测并评估柳枝稷SSR标记在糜子中的应用。王瑞云等[19]利用85对引物对我国6个生态地区的98份黍稷材料展开研究，分析得到的遗传主要参数，多态性信息含量（PIC）为0.400 0~0.728 1，平均为0.472 3。连帅等[20]研究了5个生态地区的40份黍稷的遗传多样性，结果发现15个等位变异，平均多态性信息含量为0.48。董俊丽等[21]利用96份黍稷种质资源对我国各地区的黍稷资源的遗传差别进行了分析，同时也研究了我国黍稷与俄罗斯黍稷之间的遗传差异，结果表明，俄罗斯的黍稷资源与我国的黍稷资源有较大的差别，我国和俄罗斯的黍稷种质资源有很大的遗传距离。LIU等[22]采用67对SSR引物对4个群组的黍稷栽培种和地方品种的遗传多样性进行评估并分析其主成分，共检测到179个等位变异，共有67个标记，平均为2.672，有效等位基因数（Ne）平均为1.995，遗传多样性指数（I）平均为0.725。王璐琳等[23]开发了17个微卫星标记，并分析了不同黍稷之间的遗传差异，新标记使得黍稷分子标记更为丰富，方便了对黍稷的遗传研究。寇淑君等[24]利用22对引物对国内131份黍稷材料进行遗传多样性分析，共检测出128个主要等位变异，平均每个位点为5.82，I平均为0.628 4，Ne平均为0.587 4，结果表明，不同生态区的黍稷资源遗传差异较大，但不同生态区之间存在基因交流。尽管前人利用分子标记对黍稷遗传多样性进行了大量研究，但目前尚缺乏可进行准确可靠遗传差异分析的分子标记，所以，构建大批微卫星标记以促进黍稷的高效利用势在必行[25]。而且我国黍稷资源众多，各个地区遗传差异性较大，遗传背景复杂，而黍稷属于小杂粮作物，对资源遗传多样性的研究也不够。

本研究利用80对高基元SSR引物对48份北方春糜子区的黍稷材料进行PCR扩增检测其多态性，以了解北方春糜子生态区的黍稷遗传差异，旨在为进一步改良种质资源和筛选优质基因提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为48份黍稷资源，来自中国农业科学院作物科学研究所（具有统一编号），农家种和育成品种（无统一编号）由山西农业大学农学院糜子分子育种实验室收集，分布于北方春糜子区的青海、甘肃、内蒙古、山西等4个省份（表1）。

表1 48份黍稷资源概况Tab.1 Overview of 48 broomcorn millet resources

1.2 基因组DNA提取与DNA质量检测

选取试验材料，剪取三叶期幼苗叶片，用保鲜袋封存放置在-80℃冰箱备用。利用改良的CTAB法[26]将叶片进行研磨后经过离心管离心提取黍稷基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，并用NanodropND1000核酸浓度检测仪检测DNA的浓度。测定浓度后加入双纯水稀释浓度调至30~80 ng/μL。

1.3 PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

PCR反应体系及扩增程序来源于陈小红等[25]的方法，退火温度根据不同Tm值设定，PCR产物于4℃保存，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

1.4 数据分析

将不同样品PCR扩增出条带以（0，1）进行记录，构建数字指纹图谱。用PowerMarker 3.25[27]分析多态性信息含量，用PopGen 1.32[28]对80对SSR引物扩增的产物进行多样性分析，用MEGA 5.0[29]构建聚类图，用Structure 2.2[30]分析群体遗传结构，用NTSYSpc 2.11进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 基于特异性SSR标记的遗传多样性分析

用80对高基元SSR引物扩增48份黍稷材料，结果表明（表2），在48份材料中检测到206个等位变异，共有80个标记，每个位点检测到2~3个，平均为2.575个；其中，产生2个变异的位点有34个，产生3个变异的位点有46个。80个位点多样性指数介 于0.665 5（RYW95）~1.078 6（RYW166），平均为0.860 8；有效等位基因数介于1.896 1（RYW95）~2.888 7（RYW166），平均为2.312 6。Nei's期望杂合度最大的是0.653 8，最小的是0.472 6，平均为0.559 3。80个位点PIC值介于0.185 0（RYW151）~0.706 2（RYW111），平均为0.453 6。

表2 80对引物测定的遗传参数Tab.2 Genetic parameters measured by 80 pairs of primers

续表2 80对引物测定的遗传参数Tab.2（Continued） Genetic parameters measured by 80 pairs of primers

2.2 不同来源黍稷资源群体间的遗传变异分析

对北方春糜子区的4个省区黍稷资源的遗传多样性参数进行分析（表3），发现青海材料PIC值最高，山西的PIC值最低。甘肃与山西试材的遗传距离（0.045 6）最大（表4），遗传一致度（0.955 5）最低；内蒙古与山西试材的遗传距离（0.028 6）最小，遗传一致度（0.973 6）最高。

表3 不同来源黍稷的遗传多样性分析Tab.3 Genetic diversity analysis of broomcorn millet from di fferent sources

表4 不同群体黍稷资源的遗传距离与遗传一致度Tab.4 Genetic distance and genetic consistency of different populations of broomcorn millet resources

2.3 不同地区黍稷的聚类分析

根据UPGMA聚类（图1），将48份试材归为3个群组，第Ⅰ群组含有5份试材，其中青海资源最多（4份），占80%。第Ⅱ群组有17份试材，主要包括山西资源（9份），占52.94%。第Ⅲ群组有26份试材，包含甘肃和内蒙古的黍稷资源，甘肃黍稷资源（9份）占34.62%，内蒙古黍稷资源（12份）占46.15%。从聚类分析可以看出，第Ⅰ类群有着少量的甘肃黍稷，第Ⅱ类群有着少量的内蒙古黍稷和甘肃黍稷，第Ⅲ类群有着少量的山西黍稷，各群体之间存在着少量的交叉现象。

2.4 基于模型的黍稷资源群体结构分析

对黍稷试材的所有基因建库，然后建立模型进行群体结构分析，发现48份黍稷试材的等位变异频率特征数Delta K在K=4处峰值明显（图2）。

利用Structure将黍稷试材划分为4个群组（表5、图3）。其中，红色类群9份，包括青海5份、甘肃2份、内蒙古1份、山西1份；绿色类群14份，包括青海3份、甘肃3份、内蒙古6份、山西2份；蓝色类群12份，包括青海2份、甘肃6份、内蒙古2份、山西2份；黄色类群13份，包括青海3份、内蒙古5份、山西5份。

表5 遗传结构图中各类群的统计Tab.5 Statistics of groups in structure graph 份

对K=4遗传结构（图3）和每个类群的遗传多样性参数进行分析评估（表6）。从PIC值来看，红色类群（0.467 9）＞蓝色类群（0.397 6）＞绿色类群（0.382 7）＞黄色类群（0.377 9）；根据多样性指数比较可以得到，红色类群（0.848 0）＞蓝色类群（0.845 9）＞绿色类群（0.836 9）＞黄色类群（0.805 3）；红色类群的参数均最高；黄色类群的参数均最低。综合来看，4个类群的遗传多样性丰富度的大小为红色类群＞蓝色类群＞绿色类群＞黄色类群。

表6 遗传结构图中各分类群的多样性统计Tab.6 Diversity statistics of groups in structure graph

2.5 不同地区黍稷的主成分分析

从图4可以看出，前3个主要组件PC1（Dim-1）、PC2（Dim-2）、PC3（Dim-3）分别解释总方差的14.80%、5.04%、4.31%，这些主要组件累积解释了24.15%的遗传变异。PC将北方春糜子区的所有黍稷试材划分为了4个类群，第1类群共13份，全部来自青海；第2类群共10份，全部来自甘肃；第3类群共17份，其中包括内蒙古的全部试材，1份甘肃试材和2份山西试材；第4类群共8份，全部来自山西，这与聚类分析结果基本一致。

3 结论与讨论

刘笑瑜等[31]通过6对黍稷特异性SSR对40份黍稷种质资源进行研究，共检测出20个等位基因变异，平均多样性指数为0.54，PIC平均值为0.34。连帅等[32]从162对SSR引物中筛选出了63对具有多态性的引物，利用这些多态性引物检测出161种等位变异，平均多样性指数为0.627 5，PIC平均值为0.485 5。王瑞云等[33]用85对高基元SSR扩增96份国内黍稷资源，共检测出232个等位变异位点，平均多样性指数为0.770 8，PIC平均值为0.472 3。本试验用80对SSR引物检测分析后得到206个等位变异位点，平均为2.575个；多样性指数为0.665 5~1.078 6，平均为0.860 8，PIC平均值为0.453 6。本研究的PIC值比刘笑瑜等[31]的PIC值高，可能是由于本次试验材料比较单一。但本研究发现，RYW111的各遗传参数都比较高，尤其是PIC值，说明RYW111有很好的遗传变异潜力。本研究与连帅等[32]相比较平均PIC值较低，主要是由于本试验材料选自一个生态区，而连帅等[32]选取的国内外黍稷资源来自不同生态区，遗传差异较大，遗传背景较为丰富。本研究与王瑞云等[33]相比平均PIC值较低，主要是由于王瑞云等[33]试材地理来源差异显著。

王瑞云等[34]根据遗传距离，用15个标记将132份黍稷材料进行UPGMA聚类，共分为4个群组，包括群组Ⅰ（北方春糜子区）、群组Ⅱ（黄土高原春、东北春糜子区、夏糜子区、北方夏糜子区和北方春糜子区）、群组Ⅲ（黄土高原春、夏糜子区）、群组Ⅳ（黄土高原春、北方春糜子区、夏糜子区、东北春糜子区）。连帅等[32]将192个材料划分为10个参试群体，采用UPGMA法绘制了树状聚类图，发现其遗传距离频率在0.06~0.37，频率为0.09时将所有参验材料分为三大群组，发现地理位置差异对聚类分析有一定影响。本研究则利用UPGMA将北方春糜子区的48份试材划分为3个主要类群，发现以UPGMA为依据划分的第3类群包括来自甘肃、内蒙古、青海、山西的材料，而来自青海的材料在3个类群中都有分布。基于Structure的聚类结果表明，第1类群、第2类群、第3类群都包括甘肃、内蒙古、青海、山西的材料，第4类群包括青海、内蒙古、山西的材料，4个类群中都有青海、内蒙古、山西的材料。一般来说，北方春糜子区的每个省份都有相对清晰的群体结构，与其地理起源基本一致，与BONMAN等[35]、王舒婷等[36]关于大宗作物和山西黍稷的研究结果一致。结果表明，从类群Ⅰ到类群Ⅲ的遗传参数有着明显的差异，还可以清楚地看出各选材的亲缘关系，但群体之间有少数交叉现象，与王瑞云等[34]具有类似的结果，材料地理来源对聚类有一定的影响。HUNT等[18]用16个微卫星位点对98份黍稷地方品种进行遗传结构的分析，聚类分析发现，每个集群都显示出明确的地理相关。本研究用Structure 2.2对结果进行聚类分析，在K=2时，将材料划分为2个类群，K=4时，划分4个类群。其结果也表明，遗传距离聚类与地理来源有关。

本试验的48份资源可以划分为4个类群，群组划分的结果与试材来源省份密切相关。红色类群收集的青海黍稷更多，多样性指数和PIC值更高，而黄色类群收集的山西黍稷资源更多，多样性指数和PIC值较低，这表明青海与山西间遗传结构有很大差异。总体而言，红色类群的遗传多样性参数为最高；黄色类群的遗传多样性参数都为最低。结果表明，青海材料的遗传多样性较丰富，而山西材料的遗传多样性较低一些。

本研究结果表明，80对高基元SSR引物可检测北方春糜子区48个黍稷材料的多态性；青海省黍稷种质资源的遗传多样性参数最为丰富，遗传背景更为复杂；遗传聚类群与参试材料地理来源基本一致。