李伟绪 张勉 卢梦 张浩 卢晓琳 曹猛

牙周炎是一种由细菌引起的慢性感染性疾病，可导致牙周韧带和邻近的牙槽骨破坏［1］。其是导致成年人牙齿丧失的主要原因并与多种全身系统性疾病密切相关［2］。但传统牙周炎治疗方法效果有限，因此近年来利用间充质干细胞修复重建牙周组织成为牙周炎治疗的新方向［3］。牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）是一种来源于牙周膜的间充质干细胞，具有多向分化潜能。目前研究已证实正常牙周组织来源的PDLSCs在动物与人体内的牙周组织重建中均取得了良好的效果［4－5］。但是，在炎症微环境条件下，PDLSCs的生物学特性发生转变，表现为免疫调节功能和再生潜能受损成为炎性PDLSCs。如何逆转炎性PDLSCs的生物学特性、使其充分发挥牙周组织再生的关键作用，已成为相关领域研究的关键问题［6］。单免疫球蛋白白细胞介素1受体相关蛋白（single Ig IL-1-related receptor，SIGIRR），又称 Toll／白细胞介素 1受体8（interleukin-1 receptor8，IL-1R8），是含有TIR结构域的受体家族中的一员，抑制白细胞介素1受体（interleukin-1 receptors，IL-1R）和Toll样受体（toll-like receptors，TLR）信号，在炎症反应中发挥抗炎作用［7］。然而，SIGIRR在PDLSCs是否表达，其是否参与PDLSCs的炎症反应目前尚未见报道。

本研究通过免疫荧光验证了SIGIRR在PDLSCs中表达，之后用RT-PCR检测模拟炎症微环境下不同刺激浓度与时长下PDLSCs中SIGIRR的表达水平。并通过在上调PDLSCs中的SIGIRR表达后，再施加炎症刺激，观察相关炎症因子表达变化，探讨 SIGIRR在PDLSCs中的抗炎作用，为牙周的治疗提供研究基础和治疗方向。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与仪器

α-MEM培养基（Gibco，美国）；I型胶原酶、脂多糖（LPS）（Sigma，美国）；实时定量 PCR试剂盒、cDNA反转录试剂盒（Takara，日本）；SIGIRR（1∶500，Gene Tex，美国）；引物 （北京奥科生物）；胎牛血清（四季青，浙江天杭生物科技公司）；SIGIRR过表达质粒（上海吉满生物科技公司）；Real-time PCR（7500 Applied Biosystems，美国）；细胞培养箱（Thermo，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 PDLSCs的分离与培养 采用年龄18～35岁患者拔除的正畸牙，用PBS冲洗后取牙周膜组织，加入Ⅰ型胶原酶，37℃避光消化1 h。加入培养液终止后800 r／min离心5min，弃上清液后完全培养基重悬接种于六孔板中，放置在37℃、5% CO2孵箱中培养。原代牙周膜干细胞为从组织块中爬出的细胞，经过干细胞鉴定与成骨成脂分化实验与克隆形成实验后用于后续实验。

1.2.2 不同浓度LPS刺激下炎症因子与SIGIRR表达变化 分别接种P3的PDSLCs于六孔板和共聚焦小皿中，细胞汇合度达90%后，分别加入0、10、100、1 000 ng／mL LPS模拟炎症刺激，6 h后提取RNA，检测各组IL-6、IL-8、TNF-α与SIGIRR的表达水平，引物序列见表1。而共聚焦小皿中细胞用4%多聚甲醛固定，15 min后加入0.2% Triton X-100，10 min后PBS冲洗，加入5%山羊血清室温封闭，30 min后加入一抗4℃过夜孵育。次日PBS冲洗后加入荧光二抗室温避光孵育，2 h后PBS冲洗加入DAPI室温染色，20min后用PBS清洗在共聚焦显微镜下观察，拍照。

1.2.3 不同时长LPS刺激下PDLSCs的SIGIRR与炎症因子表达变化 接种P3的PDLSCs于六孔板，细胞汇合度达90%后，在PDLSCs中加入1 000 ng／mL LPS模拟炎症刺激，分别于LPS刺激0、3、6、12、24 h后提取RNA，检测各组SIGIRR与炎症因子的表达水平。

1.2.4 SIGIRR过表达质粒转染 PDLSCs后，在 LPS刺激下炎症因子的表达变化 将P3细胞接种至六孔板，转染前12 h换不含血清与双抗的培养液，细胞汇合度达70%。转染试剂为X-treme GENE HP DNA，实验组（OE）加入SIGIRR过表达质粒，正常对照组（NC）加入空白质粒，6 h后更换为完全培养基。48 h后提取RNA检测其过表达效率。SIGIRR过表达质粒转染PDLSCs 48 h后，加入终浓度1 000 ng／mL LPS培养6 h后提取RNA，检测各组IL-6、IL-8、TNF-α的表达水平。

1.3 统计学分析

用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，组间比较用 One-way ANOVA，P＜0.05即统计学上具有显著性差异。

2 结 果

2.1 随着LPS浓度增加，炎症因子表达不断上调

对PDLSCs进行培养，同时施加不同浓度的LPS诱导炎性反应，培养6 h后提取细胞mRNA，RT-PCR结果表明，随着LPS浓度增加，PDLSCs的IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA表达逐渐升高（图1）。

2.2 SIGIRR表达随着LPS的浓度增加不断下降

为了明确PDLSCs中是否有SIGIRR的表达，我们首先用免疫荧光染色检测了正常培养条件下PDLSCs中SIGIRR蛋白的表达，共聚焦荧光图像显示PDLSCs中有SIGIRR表达，且主要定位于细胞膜和细胞质。而利用LPS刺激PDLSCs后，SIGIRR的荧光强度显著降低，且随着LPS浓度增加，SIGIRR表达逐渐下调，当LPS浓度为1 000 ng／mL时荧光强度最弱，RT-PCR结果也与之相似（图2）。

图2 不同LPS浓度对SIGIRR表达水平的影响Fig 2 The effects of different LPS concentrations on the expression of SIGIRR

2.3 随着LPS刺激时间增加，SIGIRR表达先下降后恢复正常，炎症因子表达先上升后下降

在LPS浓度为 1 000 ng／mL时不同时间刺激PDLSCs，随着LPS刺激时长增加SIGIRR表达在短时间内下调，到6 h时表达水平最低，随后逐渐上升并在24 h时恢复到原来水平。与之相反，炎症因子表达先升高后降低（图3）。

图3 不同LPS刺激时间对SIGIRR与炎症因子表达水平的影响Fig 3 The effect of different LPS stimulation time on the expression of SIGIRR and inflammatory factors

2.4 过表达SIGIRR后，LPS刺激下的PDLSCs炎症因子表达下调

相对于NC组，OE组PDLSCs中SIGIRR的上调显著（图4）。对SIGIRR过表达组施加LPS刺激，RTPCR结果显示相对于 LPS刺激组和 NC＋LPS组，OS＋LPS组的 PDLSCs中 IL-6、IL-8、和 TNF-α的表达均显著降低（图5）。

图4 过表达质粒转染与过表达效率Fig 4 Overexpression plasmid transfection and overexpression efficiency

图5 LPS刺激过表达SIGIRR的PDLSCs后炎症因子表达水平变化Fig 5 Changes in the expression of inflammatory cytokines after LPS stimulation of PDLSCs overexpressing SIGIRR

3 讨 论

牙周炎是由菌斑微生物所引发的多种因素参与的慢性感染性疾病［8］。牙菌斑是导致牙周炎的始动因素［9］，致病菌可释放包括LPS在内的多种毒力因子。LPS可刺激牙周膜中的PDLSCs分泌 TNF-α、IL-6、IL-8等炎症因子，促进牙周膜和牙槽骨的破坏［1］，使PDLSCs持续处于炎症刺激中，生理功能与多向分化能力都发生改变［10］，进而导致牙周组织的自我修复能力减弱，加速牙周炎的进展。因此本实验选择LPS模拟炎症微环境，探索SIGIRR对PDLSCs炎症状态的影响。

SIGIRR是 IL-1R／TLR受体超家族成员，在 IL-1R／TLR受体的负性调节中起关键作用［11］。SIGIRR广泛表达于多种上皮组织，尤其是肾、消化道、肝、肺和淋巴器官的上皮细胞［12］。本课题组通过免疫荧光首次证实SIGIRR也表达于PDLSCs中，且与PDLSCs的炎症反应调控密切相关。当LPS浓度为1 000 ng／mL时，PDLSCs处于明显的炎症状态中，炎症因子的表达水平最高。而与之对应地，此时SIGIRR表达下调也最多。这也与Li等［13］用LPS刺激膀胱上皮细胞所得出得结论相同，该结果提示SIGIRR表达显著降低可能是PDLSCs抗炎能力降低的原因之一。然而LPS导致的SIGIRR的下调并不是持续性的，实验发现在LPS刺激6 h时，SIGIRR下调最多，之后随着刺激时间延长SIGIRR的表达水平又逐渐恢复到正常水平，而炎症因子的表达水平与之正相反，表现为先升高后降低。这表明SIGIRR可能在早期下调增强牙周组织的炎症反应，并在组织损伤过程中清除病原菌。而随后的上调可以反过来减轻炎症反应而造成的损害，SIGIRR在炎症刺激下的表达水平的动态变化可以维持PDLSCs在炎症反应中的动态平衡。

有研究报道LPS刺激小肠上皮细胞时，其炎症因子表达升高同转录因子SP1与SIGIRR启动子结合能力的下降相关，而SP1与SIGIRR启动子结合活性随LPS刺激时间的变化趋势也与SIGIRR的变化趋势相同［14］。由于 SIGIRR在 IL-1R／TLR受体所参与的炎症反应中发挥抗炎作用，下调SIGIRR会导致细胞炎症程度加重，并且体内实验表明感染结核分枝杆菌的SIGIRR基因缺陷小鼠与对照组相比发生了剧烈的炎症反应［15］。为此本实验上调了PDLSCs中的SIGIRR表达水平，而后用LPS模拟炎症刺激发现过表达SIGIRR组的细胞中TNF-α、IL-6、IL-8表达水平均低于对照组。这一实验结果也进一步印证了SIGIRR在PDLSCs的炎症反应中也发挥抗炎作用。

以上结果表明，SIGIRR参与了PDLSCs炎症反应的调控，SIGIRR的表达也受炎症反应影响。但是炎症反应如何影响了SIGIRR的表达，SIGIRR表达变化后又会对牙周炎进程产生怎样的作用尚不清楚，这些相关机制仍需要进一步的研究。