戴太强 王乐 高晔 吕前欣 靳丹 鲍涵 刘富伟 孔亮

颞下颌关节软骨在承受咀嚼力、润滑、关节运动等方面具有重要作用，其功能发挥很大程度依赖于关节软骨基质［1］。颞下颌关节髁突表面软骨为继发性软骨，发育过程易受内外因素影响，造成关节软骨基质异常，从而影响关节功能［2］。因此，研究关节软骨细胞外基质的分泌调控因素，对于阐明软骨发育性疾病的发生发展具有重要意义。

酪蛋白激酶2相互作用蛋白-1（casein kinase 2-interacting protein-1，CKIP-1）是具有广泛作用的转录调控因子，在多种细胞功能中发挥重要调控作用［3］。然而，CKIP-1是否对软骨细胞基质分泌具有调控作用尚未见明确报道。本课题前期研究发现CKIP-1－／－小鼠颞下颌关节软骨基质减少，在本研究中以软骨祖细胞ATDC5为研究对象，借助细胞生物学、分子生物学及生物信息学手段，探究CKIP-1调控ATDC5细胞外基质分泌的生物学功能及可能的分子机制，以期为CKIP-1对颞下颌关节软骨基质的调控作用研究提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选育6对8周龄同窝雄性CKIP-1敲除的纯合（CKIP-1－／－）与野生型（WT）C57BL／6小鼠（中国人民解放军军事医学科学院构建），用于观察CKIP-1对颞下颌关节软骨基质的影响。

1.1.2 实验细胞 小鼠软骨祖细胞ATDC5购自丰晖生物有限公司（CL0036），含10%胎牛血清（杭州四季青）及1%青链霉素的DMEM／F-12培养基（HyClone，美国），于37℃，5%CO2条件下培养，1∶3传代。

1.2 方法

1.2.1 颞下颌关节组织切片 制备分离获取WT与CKIP-1－／－小鼠颞下颌关节，4%多聚甲醛固定，10%EDTA脱钙，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡后包埋切片，备用。

1.2.2 番红O染色 切片常规脱蜡、水化。0.02%固绿浸染5 min，弱酸溶液快速洗涤10 s，0.1%番红O浸染5 min，脱水，透明，中性树胶封片。Image J分析番红O染色面积。

1.2.3 CKIP-1低表达 ATDC5细胞株的建立 将ATDC5以1×104个／孔接种至24孔板，培养24 h后，实验组及对照组分别加入2×105TU LV＿siCKIP-1（siRNA 有 义 链 序 列： 5′-CCTGAGTGACTATGAGAAGTT-3′）与 LV＿si NC（siRNA有义链序列：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGTTT-3′）慢病毒（上海吉凯生物公司）感染细胞。12 h后更换新鲜培养基，72 h后观察细胞感染效率；含8μg／mL嘌呤霉素的完全培养基筛选1周后，利用单细胞克隆法获得CKIP-1低表达的稳定细胞株。

1.2.4 qPCR检测 提取细胞总RNA，10μL体系反转录，20μL体系（10μL TB Green，10 pmol特异性引物）PCR反应（试剂均来自Takara，日本）。反应条件：95℃变性15 s，60℃退火30 s，循环40次。GAPDH为内参基因，按2－ΔΔCT计算基因相对表达量，引物序列见表1。

1.2.5 Western blot检测 提取细胞总蛋白，BCA法定量。取15μg总蛋白进行凝胶电泳，恒压100 V转膜60min，5%脱脂牛奶封闭，4℃孵育anti-CKIP-1抗体（1∶300，武汉三鹰生物技术有限公司），anti-GAPDH抗体（1∶1000，CST，美国）过夜。次日 1×TBS-T洗膜，室温孵育二抗（1∶10000，CST）1 h后洗膜，利用 Chemi化学发光成像系统检测结果。

1.2.6 ATDC5成软骨诱导 按 2×105个／孔接种对照及CKIP-1敲低ATDC5至六孔板行成软骨诱导，每3 d换液。成软骨诱导14 d后，取细胞膜片制备切片，行HE、阿利新蓝及甲苯胺蓝染色观察细胞外基质分泌情况，染色步骤按照说明书进行。

1.2.7 转录组测序 Tizol法提取CKIP-1稳定低表达ATDC5及对照组细胞总RNA（各3个重复样本），质控检测后，建立文库，使用illuminaNovaseqTM6000（杭州联川生物）按照标准操作进行双端测序，测序模式为PE150。

1.2.8 测序结果 分析将原始数据去除低质量和重复序列，使用 HISAT2（https：／／daehwankimlab.github.io／hisat2）将得到的数据比对到小鼠基因组上，利用StringTie（http：／／ccb.jhu.edu／software／stringtie）对转录本初组装，将所有样本的初组装结果合并，用gffcompare （http：／／ccb.jhu.edu／software／stringtie／gffcompare.shtml）检测转录本与参考注释的比较得到最终组装注释结果。使用ballgown包提供文件输入进行FPKM定量（FPKM ＝total＿exon＿fragments／mapped＿reads（millions）×exon＿length（kB）），同时对样本之间进行显著差异分析，将差异倍数FC＞2倍或FC＜0.5倍且P＜0.05的基因定义为差异基因，并对其进行GO和KEGG富集分析。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 CKIP-1敲除对小鼠颞下颌关节软骨的影响

番红O染色显示，与 WT小鼠相比，CKIP-1－／－小鼠颞下颌关节髁突软骨异常（图 1A），成熟肥大软骨细胞层的细胞数目显著减少（图 1B，P＜0.05），且软骨细胞外基质含量显著减少（图 1C，P＜0.01），提示CKIP-1可能参与调控软骨细胞外基质合成与软骨细胞分化。

图1 CKIP-1对颞下颌关节软骨基质影响分析 （×200）Fig 1 Evaluation of the effects of CKIP-1 on temporomandibular joint cartilage ECM （×200）

2.2 CKIP-1敲低ATDC5细胞株的建立

为探明CKIP-1在调节软骨细胞外基质分泌或软骨形成方面的生物学功能，利用小干扰RNA慢病毒构建CKIP-1敲低的ATDC5细胞系（载体信息如图 2A所示）。结果显示，慢病毒成功转染细胞（图2B）。与对照组相比，CKIP-1敲低ATDC5细胞株中CKIP-1的mRNA及蛋白水平显著降低（P＜0.001），CKIP-1的沉默效率可高达80%以上（图2C），表明CKIP-1稳定低表达的ATDC5软骨细胞株构建成功。

图2 CKIP-1敲低ATDC5细胞株的构建与鉴定Fig 2 Construction and identification of ATDC5 cell strain with CKIP-1 knockdown

2.3 CKIP-1对软骨细胞外基质合成的影响

利用14 d成软骨诱导模拟成熟软骨细胞外基质分泌状态。HE染色显示两组膜片均为复层细胞结构，CKIP-1敲低组膜片组织量较对照组减少，且其组织结构相对紊乱、松散，可见软骨细胞散落于基质外（红箭头所示）。阿利新蓝染色示CKIP-1敲低组与对照组未见显著差异，甲苯胺蓝染色中，CKIP-1敲低组细胞外基质含量较对照组显著减少（图3）。

图3 CKIP-1敲低后对ATDC5成软骨诱导细胞外基质分泌的影响Fig 3 Evaluation of extracellular matrix secretion of ATDC5 after CKIP-1 knockdown followed by chondrogenic induction

2.4 CKIP-1敲低ATDC5细胞转录组测序结果分析及验证

提取CKIP-1敲低及对照ATDC5细胞总RNA进行转录组RNA-seq测序分析（图4A），发现CKIP-1敲低后对679个基因表达产生了显著影响（差异倍数＞2或＜0.5），其中378个基因显著上调，301个基因下调（图4B，4C）。对679个差异显著基因进行“生物学过程”GO富集，65%以上的显著差异基因与细胞分化功能有关，50%以上的显著差异基因与细胞信号转导有关（图4D），表明CKIP-1可能在调控软骨祖细胞分化及信号传导方面具有重要的生物学功能。随后通过“软骨及软骨细胞的所有条目”对显著差异基因进行GO富集分析，结果显示有5个基因与软骨发育相关（Sox6、Nog、Edn1、Cola1、Msx1），4个基因与软骨细胞分化相关（Mef2c、Bmp4、Tgfbi、Hmga2），同时也与软骨细胞增殖及软骨形态形成具有显著的相关性（图4E）。

KEGG信号通路富集分析结果显示，CKIP-1敲低后对软骨具有重要调控作用的Hedgehog、Wnt／β-catenin以及PI3K／Akt信号通路都具有明显的影响（图4F），其中对Hedgehog信号通路影响最为显著。qPCR验证结果与测序一致，CKIP-1敲低后软骨相关基因Col2a、Sox6、Edn1及 Hmga2的表达显著降低，Cola1、Tgfbi的表达显著升高（图 4G）；Hedgehog信号通路的下游的关键基因Gli1与Bcl2的表达显著降低（图4H），表明CKIP-1敲低后Hedgehog信号转导受到抑制。

图 4 转录组测序分析及结果验证 （*P＜0.05，**P＜0.01）Fig 4 Results of transcriptome sequencing analysis and verification by qPCR（*P＜0.05，**P＜0.01）

3 讨 论

CKIP-1作为负调控因子影响骨形成而受到广泛的关注［3－5］。然而，其在软骨组织中是否具有调控作用尚未可知。本研究中发现CKIP-1－／－小鼠颞下颌关节软骨基质流失，且CKIP-1敲低后软骨细胞的细胞外基质合成能力显著减弱。通过转录组测序与生物信息学筛选验证，发现CKIP-1对软骨发育及分化相关的Hedgehog等经典信号通路具有显著的影响，这初步揭示了CKIP-1对颞下颌关节软骨基质的影响，为进一步探明CKIP-1在调控颞下颌关节形成方面的生物学功能及其作用机制提供了实验依据。

Hedgehog、Wnt／β-catenin以及 PI3K／Akt信号通路对关节软骨形成具有重要调控作用。其中Hedgehog信号通路对出生后颞下颌关节髁突软骨的髁突表层／祖细胞层发育和功能至关重要，其在幼年小鼠中的敲除会导致髁突的退行性改变，表现为髁突软骨细胞异常成熟和软骨下骨形成［6－7］。而Wnt信号在调控软骨细胞肥大和软骨内骨化方面具有重要作用［8－9］。有研究表明增强Wnt信号通路的激活可导致小鼠颞下颌关节软骨发生适应性反应，如软骨厚度及软骨蛋白聚糖积累增强，以防止软骨降解［10］。PI3K在软骨生成和软骨细胞分化中起着重要的作用［11－13］。研究表明PI3K-Akt信号的激活抑制了软骨细胞从增殖到肥大分化的过渡，但促进了软骨细胞的终末分化［14］。本研究结果证实，CKIP-1敲低后会造成Hedgehog、Wnt／β-catenin以及PI3K／Akt信号通路不同程度的抑制，从而影响关节软骨形成及细胞分化成熟，最终造成关节软骨基质的减少。其中，以对Hedgehog信号通路的影响最为显著。以上结果也表明，CKIP-1可能是颞下颌关节软骨相关调控信号通路中的重要作用靶点，但其明确的作用机制还需要后续研究进一步验证。

综上，CKIP-1在颞下颌关节软骨调控中具有重要作用，敲低或敲除CKIP-1可造成颞下颌关节软骨基质的减少，其作用可能是影响软骨细胞的成熟和细胞外基质分泌功能，并通过与软骨调控具有重要关系的Hedgehog等信号通路来实现。因此，维持或促进CKIP-1的表达可能对软骨基质的形成和发育具有促进作用，本研究为CKIP-1对颞下颌关节软骨基质的调控作用提供了理论支持，并为颞下颌关节软骨发育异常造成的基质减少提供了可能的治疗靶点。