王杨欣， 陈 萱， 范鑫博， 张 先， 李范洙*， 李 敏

(1. 延边大学 农学院；2.延边特色产业发展中心：吉林 延吉 133000)

寒葱(AlliumvictorialisL.)具有良好的抗氧化、抑菌[1-2]、防止动脉硬化[3]、减缓皮肤衰老[4]、预防治疗糖尿病并发症[5]等作用。近几年，延边大学农学院农产品加工与贮藏实验室已对寒葱粗提物的化学成分及抗氧化活性进行了初步研究。寒葱中的维生素C含量高于部分常见果蔬[6]，含有酚类、黄酮类物质及皂苷等多种生物活性物质，并且具有良好的抗氧化活性。但主要是对寒葱粗提物的研究，为进一步分离出寒葱粗提物中的抗氧化作用效果较好的组分，该研究拟利用不同极性有机溶剂对寒葱粗提物进行梯度萃取，测定寒葱不同极性萃取物总酚、总黄酮、总皂苷的质量分数，HPLC法分析黄酮类物质，并通过对自由基的清除率以及还原力的测定探究其体外抗氧化活性，以期寻找抗氧化效果最佳的萃取组分，为天然抗氧化剂以及寒葱抗氧化食品这一新资源的研究开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂

寒葱(AlliumvictorialisL.)于2019年5月采自吉林省延边地区。

正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇(分析纯，科密欧化学试剂有限公司)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、落新妇苷、芦丁、斛皮苷、槲皮素、染料木素、山奈酚、香叶木素、汉黄岑素、柳川鱼黄素、维生素C(上海源叶生物科技有限公司)、甲醇(色谱纯，美国Sigma公司)。

1.1.2 仪器与设备

JA10003N高效液相色谱仪(民桥精密科学仪器有限公司)；250×4.6 mm，5 μm C18色谱柱(日本岛津公司)；FD-1C-50高速冷冻离心机(北京博医康实验仪器有限公司)；UV-7504紫外可见分光光度计(上海欣茂仪器有限公司)；FD-1C-50冷冻干燥机(方科仪器(常州)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 寒葱粗提物及不同极性萃取物的制备

采用水回流提取法，称取1 kg寒葱鲜叶，先用15 L蒸馏水浸泡24 h后回流提取2 h，过滤后的滤渣加入10 L蒸馏水回流提取1 h，过滤后的滤渣再加入5 L蒸馏水回流提取30 min后再次过滤，合并3次的滤液。滤液浓缩至浸膏状，之后冻干24 h后取出研磨成粉末，即寒葱粗提物，于-20 ℃冰箱保存备用。

取一定质量的粗提物，用蒸馏水溶解，依次用正己烷(Hex)、二氯甲烷(DCM)、乙酸乙酯(EAC)、正丁醇(n-BuOH)进行萃取[7]，分别萃取3次，真空浓缩挥发溶剂，冷冻干燥，分别得到正己烷相、二氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相以及水相萃取物。

1.2.2 活性成分的分析

1) 总酚的测定

采用Folin-Ciocalteu法[8-9]测定总酚。取0.5 g寒葱不同极性萃取物，分别用蒸馏水定容至50 mL，量取2 mL又定容至25 mL，吸取1 mL样液于试管中，再加入1 mL 1 mol/L福林试剂和5 mL 1 mol/L碳酸钠溶液，用蒸馏水定容至10 mL，静止30 min后于760 nm波长测得吸光度。以单宁为标准品绘制标准曲线。

2) 总黄酮含量的测定

取0.5 g寒葱不同极性萃取物，用70%乙醇溶解定容至50 mL，各量取1 mL到试管中并分别定容至20 mL，取1 mL样液，每隔6 min分别加入0.5 mL 5% NaNO2溶液、0.5 mL 10%Al(NO3)3溶液和5 mL 4% NaOH溶液，用70%乙醇定容至10 mL，摇匀，于510 nm波长测定吸光度[10-11]。以芦丁为标准品绘制标准曲线。

3) 总皂苷含量的测定

分别称取0.5 g寒葱不同极性萃取物，用甲醇溶解定容至50 mL，各稀释一定倍数后，取0.2 mL样液于70 ℃水浴挥干溶剂，之后加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，混合摇匀，在70 ℃下再次水浴20 min后立即冷却，然后加5 mL冰醋酸，于550 nm测定吸光度[12]。以齐墩果酸为标准品绘制标准曲线。

4) 黄酮类物质定量分析

① 供试样液的制备

分析用标准品为落新妇苷、芦丁、斛皮苷、槲皮素、染料木素、山奈酚、香叶木素、汉黄岑素、柳川鱼黄素，分别用色谱级甲醇配制成不同浓度的溶液，进行标准曲线的绘制。

分别称取一定量的寒葱不同极性萃取物和粗提物，用色谱级甲醇溶液溶解并定容至1 mL，之后用0.45 μm有机滤膜过滤，待分析。

② 色谱分析条件

C18色谱柱(250×4.6 mm，5 μm，Theromo scientific)；流动相为0.1%磷酸水(A)和甲醇(B)；进样量10 μL；检测波长366 nm；梯度洗脱程序：0～20 min，45% B；20～35 min，80% B；流速0.8 mL/min；柱温30 ℃。

1.2.3 体外抗氧化活性分析

1) DPPH自由基清除率的测定

将寒葱不同极性萃取物配制成一定浓度的溶液后，取2 mL样液和 2 mL 1.0 mmol/L DPPH溶液混合均匀，在避光条件下反应20 min后测517 nm波长处吸光度，为Ai，同样方法测2 mL样液与2 mL无水乙醇混合液的吸光度，为Aj，测2 mL 1.0 mmol/L DPPH溶液与2 mL无水乙醇混合液的吸光度，为A0，按照式(1)计算样液对DPPH自由基的清除率[13-15]。试验以Vc作对照，均重复3次。

(1)

2) 羟自由基清除率的测定

采用Fenton反应法[16-17]，取2 mL样液、2 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、2 mL 8.8 mmol/L 30% H2O2溶液和2 mL 9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液，混合均匀，避光、37 ℃保温30 min，以3 000 r/min离心10 min，取上清液，于510 nm测溶液的吸光度，记为Bi；将2 mL样液替换成2 mL超纯水同样方法测吸光度，记为B0，2 mL水杨酸-乙醇溶液替换成2 mL乙醇溶液，记为Bj。按照式(2)计算样液对羟自由基的清除率。试验以Vc做对照，均重复3次。

(2)

3) 还原能力的测定

取0.1 mL样液、0.1 mL pH值6.6的磷酸缓冲溶液和0.1 mL 1%铁氰化钾溶液混合，于50 ℃水浴反应20 min，冷却后加入0.1 mL 10%三氯乙酸，以3 000 r/min离心15 min，取0.1 mL上清液，加入0.1 mL超纯水与0.01 mL 0.1%三氯化铁，静置10 min后于酶标仪700 nm波长测吸光度，记为A样品；同样方法将铁氰化钾溶液替换成0.1 mL去离子水作为空白对照组，记为A空白，还原力以A样品和A空白相差来表示[18-19]。试验以Vc做对照，均重复3次。

还原力=A样品-A空白。

(3)

1.2.4 数据分析

利用Origin 2018软件绘图；利用SPSS17.0软件，采用Duncan多重比较法对数据进行显著性差异分析，P<0.05，以及Probit回归法计算IC50值。

2 结果与分析

2.1 寒葱不同极性萃取物活性成分

由表1可知，寒葱不同极性萃取物中总酚和总黄酮质量分数均差异显著，且其质量分数大小的顺序也基本一致，其中，乙酸乙酯萃取物总酚和总黄酮质量分数最高，分别达到334.20和127.27 mg/g，其次,二氯甲烷和正丁醇萃取相的质量分数，正己烷和水相的质量分数最低，且低于粗提物的质量分数。而二氯甲烷萃取物的总皂苷质量分数为139.04 mg/g，显著高于其他萃取相，正己烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取相中皂苷质量分数约为90 mg/g，差异不显著。说明酚类和黄酮类物质主要富集在中等极性的乙酸乙酯、二氯甲烷和正丁醇相中，皂苷类物质在二氯甲烷相中质量分数最多以外，在正己烷、乙酸乙酯和正丁醇相中分布比较均匀。

表1 不同极性萃取物活性成分的含量

2.2 寒葱不同极性萃取物黄酮类物质的定量分析

从图1可以看出，正己烷萃取物色谱峰多集中20 min以后，二氯甲烷萃取物的色谱峰的保留时间多集中于15～24 min，而乙酸乙酯萃取物的色谱峰多集中于7～18 min，正丁醇萃取物的色谱峰集中在5～10 min。对葱属植物中普遍存在的芦丁、槲皮素、山奈酚以及在全谱分析中检测出来的落新妇苷、染料木素、汉黄芩素等9种黄酮类物质分析结果，在不同极性萃取物中的含量具有明显差异。

注：1.落新妇苷(Astilbin);2.芦丁(Rutin);3.槲皮苷(Quercitrin);4.槲皮素(Quercetin);5.染料木素(Genistein);6.山奈酚(Kaempferol);7.香叶木素(Diosmetin);8.汉黄芩素(Wogonin);9.柳川鱼黄素(Pectolinarigenin)。

由表2可知，乙酸乙酯萃取物较其他萃取相包含更多的黄酮类物质，包括落新妇苷8 388.5 μg/g、芦丁2 245.8 μg/g、槲皮苷1 197.21 μg/g、染料木素1 137.10 μg/g、槲皮素506.93 μg/g和山奈酚341.35 μg/g，未检测出汉黄芩素和柳川鱼黄素。其次是二氯甲烷萃取物，包含染料木素1 172.65 μg/g、柳川鱼黄素818.64 μg/g、槲皮素769.09 μg/g、香叶木素737.15 μg/g和芦丁649.48 μg/g，未检出山奈酚和落新妇苷。在正己烷萃取物中，检出染料木素、香叶木素、柳川鱼黄素和汉黄芩素，其中,染料木素质量分数最多，为997.26 μg/g。正丁醇萃取物中只检出芦丁和槲皮苷，且其质量分数较低；水相中9种物质均检出，其中,槲皮素质量分数最多，达335.45 μg/g。在粗提物中，槲皮素、染料木素以及汉黄芩素的质量分数相对较高，分别为243.30，216.19和169.25 μg/g，山奈酚质量分数次之，而柳川鱼黄素以及芦丁的质量分数相对较低，因粗提物没有经过纯化处理，所以色谱分析结果可能会受杂质的影响较大。

表2 不同极性溶剂萃取物中黄酮类物质的含量

2.3 寒葱不同极性萃取物抗氧化活性

2.3.1 对DPPH自由基的清除率

从图2可以看出，寒葱不同极性萃取物对DPPH自由基均有良好的清除活性，其中,乙酸乙酯萃取物对DPPH自由基的清除率明显高于其他萃取物，质量浓度在1.0 mg/mL以上时,清除率趋于平缓，清除率高达92.09%，类似于Vc质量浓度在0.4 mg/mL的清除率；二氯甲烷和正丁醇萃取物质量浓度为1.0 mg/mL时,清除率分别为80.92%和79.07%，接近峰值；正己烷萃取物的质量浓度为1.2 mg/mL时,清除率为76.72%，之后趋于平缓；水相萃取物对DPPH自由基的清除率最低，质量浓度在1.4 mg/mL以上时,清除率趋于稳定，此浓度下清除率为75.28%。粗提物在质量浓度1.2 mg/mL时,其对DPPH自由基的清除率达到80.22%，类似于二氯甲烷和正丁醇萃取物的峰值，之后趋于稳定。

图2 不同极性溶剂萃取物对DPPH 自由基的清除率

分析IC50值结果显示(表3)，乙酸乙酯萃取相的IC50值最小，为0.153 mg/mL，其后质量浓度由低到高依次为二氯甲烷萃取物、正丁醇萃取物、正己烷萃取物，水相萃取物的IC50值最大，为0.927 mg/mL。粗提物的IC50值为0.392 mg/mL，略高于正丁醇相。可以看出，寒葱不同极性萃取物均对DPPH自由基具有良好的清除活性，其中,乙酸乙酯相的活性最高，其次是二氯甲烷相、正丁醇相、正己烷萃取相和水相，但均不及Vc的活性。

表3 不同极性溶剂萃取物清除DPPH 自由基的IC50值

2.3.2 对羟自由基的清除率

从图3可以看出，寒葱不同极性萃取物对羟自由基也具有良好的清除能力，并呈现类似于对DPPH自由基清除活性的趋势。同样,乙酸乙酯萃取物对羟自由基的清除率明显高于其他萃取相，清除率趋于平稳后的大小为85.23%，但不及Vc的最高清除率；二氯甲烷和正丁醇萃取物以及粗提物的清除率曲线基本一致，浓度为1.6 mg/mL以上时清除率趋于平缓，清除率分别为79.27%、81.69%和78.43%；正己烷萃取物和水相萃取物的清除率趋于稳定时的浓度为2.0 mg/mL，清除率分别为78.00%和73.43%。

图3 不同极性溶剂萃取物对羟自由基的清除率

IC50值计算结果显示(表4)，乙酸乙酯相的IC50值为0.387 mg/mL,最小，其次是二氯甲烷相，为0.547 mg/mL，其后正丁醇相和正己烷相，水相IC50值最小，为1.171 mg/mL；粗提物的IC50值为0.695 mg/mL，接近于正丁醇萃取物，以上浓度的寒葱不同极性萃取物活性相当于0.08 mg/mL的Vc活性。

表4 不同极性溶剂萃取物清除DPPH 自由基的IC50值

2.3.3 寒葱不同极性萃取物的还原力

从图4可以看出，随着寒葱不同极性萃取物浓度的增加还原力也增强，呈现一定的量效关系。不同极性萃取物的还原力大小顺序与其对自由基清除率大小顺序一致，还原力由高到低依次为乙酸乙酯相、二氯甲烷相、正丁醇相、正己烷萃取相和水相，浓度约为0.3 mg/mL以上时,粗提物的还原力低于正丁醇萃取物。从图中可知，不同极性萃取物的还原力远低于Vc。

图4 不同极性溶剂萃取物的还原力

2.4 活性成分与抗氧化活性相关性分析

由表5的相关性分析可知，寒葱不同极性萃取物活性成分中总酚、总黄酮含量与其自由基清除率和还原力相关系数均为0.8以上，呈极显著正相关，总皂苷含量只与还原力有显著相关。因此，寒葱不同极性萃取物抗氧化主要成分是总酚和总黄酮，其含量的高低可以直接反映抗氧化活性的强弱。

此类题解答后有着浓厚的“回味性”：图形中还蕴藏着哪些有价值的信息点而没有被发现和揭示出来，它对下一问的解题思路有无铺垫和启发的作用；除此方法之外，还有无其他的方法，若有，这些方法之间在“质”上是否有着共同的“语言”.

表5 不同极性溶剂萃取物中的活性成分与抗氧化活性的相关性

3 讨论与结论

从试验结果来看，寒葱粗提物经过不同极性溶剂梯度萃取后，乙酸乙酯相的总酚、总黄酮含量最高，分别达到334.20和127.27 mg/g。乙酸乙酯萃取物的总黄酮含量显著高于其余萃取层,这与王丽虹等[20]的结果相同，其总酚含量最高与吴永祥[21]柳等对叶腊梅叶的甲醇粗提物萃取结果相同，但王欢等[22]对血红铆钉菇子实体的多酚萃取率研究中正丁醇相多酚含量最高，可能是材料所含的多酚种类不同。正己烷相的总酚和水相的总黄酮含量最低，而二氯甲烷相的总皂苷含量最高，为139.04 mg/g。说明不同极性萃取寒葱粗提物可以集中分离出粗提物中的物质组分，但要挑选合适的有机溶剂，乙酸乙酯是理想的萃取溶剂，曾铁鑫等[23]也报道了同样的结果。

黄酮类化合物是葱属植物的重要组成部分。葱属植物的黄酮类物质主要有槲皮素、芹菜素、山奈酚等[24]。根据HPLC法对9种黄酮类物质分析结果，乙酸乙酯相中检测出落新妇苷、芦丁、槲皮苷、染料木素、槲皮素和山奈酚等7种物质，且其含量最高，其中,落新妇苷含量最多；二氯甲烷相也分析出芦丁、槲皮苷、染料木素、槲皮素、香叶木素、汉黄芩素和柳川鱼黄素7种物质，其含量仅次于乙酸乙酯相；正己烷相中检测出染料木素、香叶木素、汉黄芩素和柳川鱼黄素4种，其中,染料木素的含量最多；正丁醇相中只检测出芦丁和槲皮苷，其含量最低；虽然水相中9种物质都被检出，但是其含量较低。

寒葱不同极性萃取物抗氧化活性顺序为乙酸乙酯相>二氯甲烷相>正丁醇相>正己烷相>水相萃取物，这与不同极性萃取物中酚类物质、总黄酮含量大小基本吻合，即总酚和总黄酮含量高,其抗氧化活性也强。根据物质分析，提取物中总酚和总黄酮的含量与其DPPH自由基清除、羟自由基清除能力和还原能力均具有极显著的正相关关系(P<0.01)。刘曦等[25]对蓝莓叶的研究也报道了相关研究结果。郭小补等[26]也发现,桑叶总黄酮含量与其体外抗氧化能力的高低呈现一定的相关关系。并且二氯甲烷相和乙酸乙酯相的抗氧化活性均优于粗提物，说明使用这2种有机溶剂萃取可以萃取出抗氧化活性强的组分。

通过溶剂梯度萃取寒葱粗提物中黄酮类物质主要富集在乙酸乙酯相中，且其抗氧化活性最高，因此，乙酸乙酯相有望开发成抗氧化剂，其功能应用研究需要进一步的探索。