陈保华 朱志贤 陈国宝

关键词：大米发酵液;保湿;修护;美白;抗氧化;功效评价

大米发酵产物因为其菌种选择和工艺控制的不同，发酵产品中成分和用途及其功效会有所差异。该研究通过对川藏高原海拔3700m雪山线附近土壤中酵母菌进行了筛选，通过平板画线法，纯化分离出19个菌株。对每个菌株进行了扩繁工作，并选取了对紫外线抵抗能力强、胞外酶较为单一的一株作为本实验的菌株母本进行扩大培育。通过分段控温、控氧的方式进行放大发酵，主要目标产物为活性低聚糖和小分子肽类、氨基酸，并对产品进行了保湿、修护、抗氧化、美白的体外功效评价。

01功效评价方案

1.1基于DPPH自由基清除的抗氧化评价

抗氧化成分可以通过清除自由基来减缓肌肤的衰老。可通过原料清除DPPH自由基的能力，来评估抗氧化活性的大小。

1.2基于角质形成细胞迁移的修护效果评价

皮肤受到损伤后，皮肤内的各种细胞主要通过细胞迁移到达损伤部位来进行修复活动，角质形成细胞的迀移能力对表皮损伤修复具有重要作用[1-2]。可以通过评估样品是否具有提升角质形成细胞迁移的能力，说明产品是否具有肌肤修护功效。

1.3基于免疫荧光法测定AQP3蛋白含量的保湿效果评价

水通道蛋白3（AQP3）可以促进内源性甘油以及皮脂腺中的甘油三酯运输进入表皮，影响皮肤保湿功效，因此上调AQP3可以达到保湿功效[3]。可以通过测试基于角质形成细胞，通过检测样品作用后，AQP3蛋白表达量的变化，评价待测样品的保湿功效。

1.4基于酪氨酸酶活性抑制、黑色素细胞的黑色素含量的美白效果评价

在皮肤黑色素生物合成中，酪氨酸酶是关键酶。评估原料对酪氨酸酶活性的抑制作用，以及通过离体培养人黑色素中的黑色素含量测定，可评估培养基中添加受试原料对黑色素的生成抑制来判定产品是否具有美白效果。

1.5测试材料

1.5.1主要试剂

无水乙醇、乙醚、氢氧化钠、氨水、一水合柠檬酸、十二水合磷酸氢二钠、DPPH（2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl）、维生素E、MTT、DMSO、酪氨酸酶、左旋多巴、黑色素标准品、KC2500、胰酶、DMEM、抗萍灭剂、Hochest33342、PBS、无表皮生长因子（EGF）、PBS、4%多聚甲醛、柠檬酸钠、Anti-AQP3抗体、Anti-Mouse-488（山羊抗鼠）、即用型山羊血清、曲酸、Medium-254、HMGS、胎牛血清。

1.5.2主要设备

酶标仪（BioTek，Epoch）、CO2培养箱（Thermo，150I）、超净工作台（苏净安泰，SW-CJ-1F）、倒置显微镜（Olympus，CKX41）、微量振荡器（其林贝尔，MM-1）、荧光显微镜（Leica，DM2500）、高速冷冻离心机（长沙湘仪，H1850R）、数显恒温水浴锅（常州国华，HH-4A）。

1.6测试方法

1.6.1DPPH自由基清除

（1）测试系统：以维生素E为阳性对照，同受试物用95%乙醇溶解稀释成不同浓度梯度进行自由基清除试验。

（2）检测：参照表1，设立样品管（T）、样品本底（T0）、DPPH管（C）和溶剂本底（C0），每一样品的每个受试浓度的样品管（T）及DPPH管（C）需设立3支平行管，按要求加液反应5min后在517nm处测定吸光值。

（3）计算DPPH自由基清除率。

1.6.2角质形成细胞迁移

（1）接种：角质形成细胞以2.5E5个/孔的接种密度接种至6孔板，培养箱（37℃、5%CO2）中孵育过夜。

（2）配液：按照试验设计（表2）配置样品工作液。

（3）给药：根据表2试验分组设计，待6孔板中细胞铺板率达到70%以上时，进行分组给药，每组设3个复孔，每孔给药量为2mL。培养箱继续培養24h。

（4）划痕、清洗、培养：孵育结束后，进行划痕后用PBS清洗，加入正常的细胞培养液，培养箱培养24h。

（5）拍照分析：划痕后0h在4倍镜下拍照;划痕24h后，用PBS清洗一次，4倍镜下拍照。应用GraphPadPrismProgram软件作图分析。

1.6.3免疫荧光法测定AQP3蛋白含量生成促进

（1）测试系统：人体角质形成细胞传代培养按4E4个/孔接种至24孔板，培养箱（37℃、5%CO2）中孵育过夜。

（2）配液：按试验设计（表3）分别配制受试物工作液。

（3）给药：根据上述表3试验具体设计，待24孔板中细胞铺板率达到30%～50%时，进行分组给药，每孔加样1mL，每组设3个复孔。给药完成后将24孔板放置在培养箱（37℃、5%CO2）中培养24h。

（4）处理：孵育培养结束后，吸弃旧液，1mL/孔PBS清洗3次，每孔加1mL4%的多聚甲醛室温固定爬片15min。固定结束后将24孔板放置于4℃下保存备用。经羊血清封闭，一抗、二抗孵育，滴加Hochest33342染色。

（5）封片观察拍照：用针头挑出爬片，在载玻片上滴加一滴抗淬灭剂并将爬片反放于载玻片上。24h内荧光显微镜拍照，分析检测结果。

1.6.4酪氨酸酶活性抑制、黑色素细胞的黑色素含量

（1）测试系统：采用培养传代人黑色素细胞为基础，设定不同浓度梯度曲酸作为阳性对照，受试物用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释为多级浓度样品。

使用1mLEp管，设立样品管（T）、样品本底（T0）、酶反应管（C）和溶剂（C0），按要求加液，置37℃水浴槽孵育l0min。依次在各管中加入400μL的左旋多巴溶液，控制每管反应时间为5min，即刻将各管反应溶液在475nm处测定吸光值。

样品加液要求具体见表4。

A.计算酪氨酸酶抑制率。

（2）黑色素含量检测

A.接种：按5E4个/孔的接种密度接种细胞至6孔板，培养箱（37℃、5%CO2）中孵育过夜。

B.配液：按照试验设计（表5）配置受试物工作液。

.给药：根据表5试验设计，待6孔板中细胞铺板率达到40%～50%时，进行分组给药，每组设3个复孔，每孔给药量为2mL。培养箱继续培养72h。

D.细胞消化提取：培养结束PBS清洗一次，加入胰酶消化，收集细胞至Eppendorf管中，离心弃上清液。加入1.2mL混合液（蒸循水：无水乙醇：乙醚=2：5：5，v/v/v），涡旋振荡，室温放置30min后，离心弃上清液，加入DMSO的NaOH水溶液，采用封口膜封口，放置于80℃水浴中加热40min。

E.检测分析：加热结束后，待温度平衡至室温后，在405nm波长测吸光度值，数值进行软件分析。

02功效评价结果

2.1基于DPPH自由基清除的抗氧化效果

检测结果显示，较高浓度条件下，该大米发酵液可通过对DPPH自由基清除达到抗氧化效果。

2.2基于角质形成细胞迁移的修护效果评价

基于测试方法，将空白对照组迁移率归一，计算各组相对迁移率，细胞迁移照片见图2所示，数据分析结果见表7和图3所示。

与BC组相比，PC组的细胞相对迁移率显著上升，说明测试体系有效。

与BC组相比，样品组酵母菌/大米发酵产物滤液-1.0%、酵母菌/大米发酵产物滤液-2.5%和酵母菌/大米发酵产物滤液-4.0%组的细胞相对迁移率均显著提高。说明该产品有修护皮肤屏障的功效。

2.3基于免疫荧光法测定AQP3蛋白含量的保湿效果评价

孵育培养结束后，细胞进行免疫荧光检测，结果汇总见图4、表8及图5。

与BC组相比，PC组的AQP3蛋白含量显著上升，样品组大米发酵液-0.5%、大米发酵液-1.0%和大米发酵液-2.5%的AQP3蛋白含量均显著上升。该大米发酵液在浓度为0.5%、1.0%和2.5%时，可通过提高AQP3蛋白的表达而发挥保湿功效。

2.4基于酪氨酸酶活性抑制、黑色素细胞的黑色素含量的美白效果评价

2.4.1酪氨酸酶抑制率检测结果

基于测试方法，进行酪氨酸酶抑制率检测，检测结果汇总如表9所示，趋势图如图6所示：

2.4.2黑色素含量抑制率检测结果

基于测试方法，进行收集细胞，进行黑色素含量抑制率测定，结果如表10所示，变化趋势图如图7所示：

与BC组相比，PC（光甘草定）组黑色素含量显著下降，黑色素含量抑制率为21.22%，说明本次测试有效。

与BC组相比，样品组酵母菌/大米发酵产物滤液-2.5%的黑色素含量显著下降，黑色素含量抑制率为21.42%。

由此說明，该大米发酵液可通过抑制酪氨酸酶活性和降低黑色素含量，发挥美白功效。

结论

选取支链淀粉及蛋白质含量更加丰富的优质有机大米为原料，经高海拔、强紫外线、极端温差的自然环境中筛选出胞外酶单一性较好的特殊菌种使用分段控温供氧工艺发酵，得到的产品保留了大米的特殊清香，没有一般酿酒酵母发酵可能产生的乳酸、丙酸、丁酸的气味，减少了有机酸对皮肤的刺激性，产品更易为消费者所接受。

另通过体外生化法与细胞法进行功效评价，结果表明该产品体外功效评价显示：在10%、25%、50%、75%、100%浓度时，DPPH清除率分别为0.39%、3.14%、5.49%、7.37%、12.08%，表明产品可通过清除自由基的方式达到抗氧化的作用。离体培养角质成形细胞划痕实验显示在浓度为1.0%、2.5%和4.0%时，可以通过促进细胞迁移达到修护功效。在浓度为0.5%、1.0%和2.5%时，可通过提高角质成形细胞中AQP3蛋白的表达而发挥保湿功效。酪氨酸酶活性抑制IC50为18.3%，基于人黑色素细胞，浓度2.5%时黑色素含量抑制率21.42%，可以达到美白效果。

基于发酵产物的多样性而言，目前可以通过硫酸苯酚法测定总糖含量、茚三酮显色法测定氨基酸含量。但具体糖类组分构成尚不明确，混合肽类成分的氨基酸连接形式也尚不明确，故具体起到保湿、美白、修护和抗氧化作用的成分有待进一步深入研究。