杨恒 钱彪 郑丽英 王勤章 郝志强 王敬珅 汪渊 李永乐 谭明辉 刘志立

[摘要]目的探究纳米细菌（NB）损伤人肾小管上皮细胞 HK-2并导致晶体滞留的机制。方法应用肾结石患者尿液培养的 NB，实验分为5组：对照组（胎牛血清、1640培养液+HK-2细胞）、NB 組（NB 菌液、胎牛血清、1640培养液+HK-2细胞）、COM 组（一水草酸钙， COM 悬液、胎牛血清、1640培养液+HK-2细胞）、nHAP组（纳米级羟基磷灰石，nHAP、胎牛血清、1640培养液+HK-2细胞）和四环素干扰组（TET+NB，四环素、NB 菌液、胎牛血清、1640培养液+HK-2细胞）。将 HK-2细胞分别与各组作用物共培养6、12、24 h 后，用光学显微镜观察 HK-2细胞的形态学变化;超声粉碎细胞后检测 Na+-K+-ATP 酶和 Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性;检测培养液中乳酸脱氢酶（LDH）、过氧化氢（H2O2）和丙二醛（MDA）含量。结果 HE 结果可见，nHAP组和四环素干扰组中 HK-2细胞的损伤程度明显低于 NB 组（P <0.05）。共同培养12、24 h 后， NB 组和 COM 组 Na+-K+-ATP 酶和 Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性均低于对照组，H2O2含量均高于对照组（P <0.05），nHAP组 Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性均低于对照组（P <0.05），四环素干扰组 Na+-K -ATP 酶和 Ca+2+-Mg2+-ATP 酶活性均高于 NB 组（P <0.05）。共同培养6、12、24 h 后， NB 组和 COM 组 MDA 含量均高于对照组（P <0.05），四环素干扰组 MDA 含量均低于 NB 组（P <0.05）; COM 组 LDH 含量均高于对照组（P <0.05），nHAP组、四环素干扰组 LDH 含量均低于 COM 组（P <0.05）。结论 HK-2细胞损伤的原因可能是 NB 通过诱导脂质过氧化反应造成的， NB 作用时间越长，损伤程度越重。四环素在一定程度上可以阻止 NB 对 HK-2细胞的损伤。[关键词]肾结石;纳米细菌; HK-2细胞;脂质过氧化;四环素

[中图分类号] R692.4  [文献标识码] A   [文章编号]2095-0616（2022）07-0021-05

Investigation on the role of nanobacteria in the formation ofrenal calculi

YANG HengQIANbiao    ZHENG Liying    WANG QinzhangHAO  Zhiqiang1，2WANG  Jingshen1，2      WANG  Yuan1，2      LI  Yongle1，2      TAN  Minghui1，2LIU  Zhili

1. Department of Urology， First Affiliated Hospital， School of Medcine， Shihezi University， Xinjiang， Shihezi 832000， China;2. First Affiliated Hospital of Gannan Medical University， Jiangxi， Ganzhou 341000， China

[Abstract] Objective To explore the mechanism of nanobacteria （NB） to damage human renal tubular epithelial HK-2 cells and lead to crystal retention. Methods The urine of patients with renal calculi was applied to culture NB. The experiment included five groups： the control group （fetal bovine serum， 1640 culture medium+HK-2 cells）， the NB group （NB bacterial solution， fetal bovine serum， 1640 culture medium+HK-2 cells）， the COM group （calcium oxalate monohydrate， i.e.， COM suspension， fetal bovine serum， 1640 culture medium+HK-2 cells）， the nHAP group （nano-hydroxyapatite， i.e.， nHAP， fetal bovine serum， 1640 culture medium+HK-2 cells） and the tetracycline （TET） interference group （TET+NB， tetracycline， NB bacterial solution， fetal bovine serum， 1640 culture medium+HK-2 cells）. HK-2 cells were co-cultured with each group of agents for 6 h， 12 h and 24 h， respectively， and then the morphological changes of HK-2 cells were observed by optical microscope. The activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase were detected after ultrasonic comminution to break cells. The contents of lactate dehydrogenase （LDH）， hydrogen peroxide （H2O2） and malondialdehyde （MDA） in the culture medium were detected. Results HE results showed that the damage degree of HK-2 cells in nHAP group and tetracycline interference group was significantly lower than that in NBgroup （P <0.05）.After co-culture for 12 and 24 h， the activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase in NB group and COM group were lower than those in control group， and the content of H2O2 was higher than that in control group （P <0.05）. The activities of Ca2+-Mg2+-ATPase in the nHAP group werelower than those in the control group （P <0.05）， and the activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+- ATPase in the tetracycline interference group were higher than those in the NB group （P <0.05）. After 6， 12， and 24 h of co-culture， the MDA content in the NB group and the COM group were higher than that in the control group （P <0.05）， and the MDA content in the tetracycline interference group was lower than that in the NB group （P <0.05）; the LDH content in the COM group was higher than that in the control group （P <0.05）， the LDH content in the nHAP group and the tetracycline interference group were lower than that in the COM group （P <0.05）. Conclusion The damage of HK-2 cells may be caused by NB-induced lipid peroxidation. The longer the action time of NB， the more serious the damage. Tetracycline can prevent NB from damaging HK-2 cells to a certain extent.

[Key words] Renal calculi; Nanobacteria; HK-2 cells; Lipid peroxidation; Tetracycline

肾结石在泌尿系结石中最常见，而肾结石中以草酸钙结石最为常见[1]，在《黄帝内经》中称之为石淋或者砂淋。目前对于该疾病的诊断和治疗已经非常成熟，比如经尿道输尿管镜激光碎石取石术、经皮肾镜钬激光碎石取石术以及体外冲击波碎石术，其中体外冲击波碎石术相对患者来说不会造成损伤，由于术后恢复良好，许多患者倾向选择该种方式[2];但其复发率较高，发病可表现为急症，不仅导致患者疼痛难忍，并且增加社会经济成本[3-4]。

芬兰科学家Kajander首次在肾结石中发现并命名了纳米细菌（nanobacteria， NB）， NB 是具有独特的生物矿化功能致病菌，它可作为活性中心，通过自身生物矿化作用的同时，还依靠黏附血液中的钙、磷等离子形成矿化颗粒，最终形成结石[5-6]。尿液中钙盐晶体形成后，会刺激肾小管上皮细胞发生病理性改变，致使肾小管上皮细胞发生炎症反应和损伤，同时诱导细胞自噬能力增强[7]。四环素是为数不多可以有效抑制 NB 生长的药物，易剑锋等[8]相关研究表示，四环素对治疗 NB 相关的慢性前列腺炎确有疗效[9]。

有研究表明肾结石与NB 存在一定的相关性[7]，所以 NB 在肾结石形成过程中的作用及其机制的研究备受关注[10-12]。本课题旨在通过研究 NB 在肾结石形成过程中的作用及其机制。

1材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

实验主要试剂及仪器见表1。

1.2  NB培养与鉴定

NB 培养与鉴定方法详见褚浩等[6]的研究。1.3 实验分组

选取 HK-2细胞，随机分为5组： NB 组、对照组、C OM 组、nHAP组和四环素干扰组。见表2。

1.4 各组细胞HE染色观察

分别在各时间点提取各组细胞，每组吸取100μl 细胞悬液，使用细胞离心涂片机进行涂片，PBS 冲洗3次，晾干;玻片经二甲苯脱蜡及梯度乙醇水化后，使用 Harris 蘇木精1 min，然后用自来水冲洗2 min，1%盐酸乙醇分化5 s，伊红染色5 min;再经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封片，于光学显微镜下观察细胞形态变化。

1.5 细胞损伤因子指标检测

①分别在6、12、24 h 取各组细胞上清液，按照试剂盒说明书分别检测 H2O2、MDA、LDH 含量;②向吸进培养液的细胞中加入0.25%胰蛋白酶并反复吹打，将细胞消化，转移至 EP 管中，分别加入 PBS 缓冲液400μl;③经超声粉碎机粉碎，用 ATP 酶试剂盒（样本前处理需高速离心）比色法测定各组细胞 ATP 酶活性。

1.6 统计学方法

运用 SPSS 24.0统计学软件进行分析，符合正态分布计量资料以均数±标准差（x ± s）表示，使用完全随机设计的方差分析，不符合正态分布的计量资料使用[M（P25， P75）]表示，采用非参数检验。 P <0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1 各组HE染色结果

NB 组部分细胞胞体膨胀增大，胞核松散，核膜模糊不清;对照组细胞形态大小均一，胞核清晰，胞浆致密，未见明显异常;COM 组细胞数目明显减少，胞核松散，部分核膜溶解，核仁消失;nHAP组细胞核膜较清晰，胞核更加致密;四环素干扰组大部分细胞形态规则、致密，胞核清晰部分细胞出现胞体膨胀，胞核松散。HE 染色结果见图1。

2.2 各组细胞损伤因子指标检测结果

NB 组和 COM 组共同培养12、24 h 后 Na+-K+-ATP 酶和 Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性均低于对照组;nHAP组共同培养12 h 后 Na+-K+-ATP 酶活性低于对照组、高于 COM 组， Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性低于对照组;nHAP组共同培养24 h 后 Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性低于对照组，高于 NB 组和 COM 组;四环素干扰素组共同培养12、24 h 后 Na+-K+-ATP 酶和 Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性均高于 NB 组，差异有统计学意义（P <0.05）。见表3。

对照组12、24 h 的 H2O2含量均低于 NB 组和 COM 组，四环素干扰组12 h 及24 h 的 H2O2含量低于 NB 组; COM 组6、12、24 h 的 LDH 含量时高于对照组，nHAP组和四环素干扰组在6 h 时 LDH 低于 NB 组和 COM 组，差异有统计学意义（P <0.05）; NB 组和 COM 组 MDA 含量均高于对照组，四环素干扰组显著低于 NB 组，差异有统计学意义（P <0.05）。见表4。

3讨论

肾结石形成的原因较多，目前尚不清楚[13-14]。邓昊[15]总结肾结石形成有以下几种假说：①血液经肾浓缩成尿液，尿液中的盐类可形成结晶，在人体钙磷代谢紊乱时出现结石;② Randall 实验研究认为是矿物质结晶在肾乳头处形成的钙化斑块导致结石形成;③部分人群未患尿结石是因为尿液中存在尿凝血酶原片断1（UPTF1）等抑制物，当抑制物发生异常或减少时可形成结石。研究者认为原因可能为 Randall 肾乳头钙化斑学说和肾小管细胞损伤学说[16-17]。归纳以上结论不难看出，结石的形成来源于矿物质结晶钙化，并且结晶可以深入肾小管间隙进一步破坏肾组织。肾结石中培养出 NB 的阳性率达90%以上，而 NB 具有独特的生物矿化作用[18]，因此 NB 感染与肾结石存在一定相关性[19-20]。

NB 在生长增殖过程中能分泌羟磷灰石类的钙化物[5]，因此，本研究设置 COM 组（5 mmol/L）和nHAP组作为对照，探究 NB 是否可对肾小管上皮细胞 HK-2产生损伤，并通过设置四环素干扰组进行验证。HE 染色结果显示各组对 HK-2破坏严重程度为 COM 组>NB 组>四环素干扰组>nHAP组>对照组，前两组出现更多的胞体肿胀等现象， COM 组同样表现核仁消失等现象。NB 组和nHAP组细胞膜亦可逐步解离，细胞刷状缘排列错乱。可见 NB 对肾小管的损害与 COM 相关性更大，直接分泌出的羟基磷灰石需凝结形成钙化晶体从而进一步对细胞产生破坏，且四环素可通过抑制 NB 减少该损害。细胞因子损伤指标检测结果显示 COM 组和 NB 组 Na+-K+-ATP 酶和 Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性均降低，而 LDH 水平较高，提示 NB、COM 可损伤 HK-2的细胞膜，在 COM 组和 NB 组中有 H2O2和 MDA 水平的升高，提示 NB 在 HK-2细胞破坏过程中存在脂质过氧化反应。刘鑫等[7]研究表明大量活性氧自由基能造成肾小管上皮细胞损伤，且能增加晶体黏附力，形成恶性循环，加剧钙化晶体沉积，形成肾结石。李军等[21]选取60例 NB 感染的Ⅲ型前列腺炎患者平均分为四环素治疗组和左氧氟沙星治疗组，连续用药1个月后，四环素治疗组疼痛、排尿症状和生活质量评分显著降低，差异有统计学意义（P <0.05）。

综上所述，可通过联合 Na+-K+-ATP 酶、Ca2+- Mg2+-ATP 酶活性及 LDH、H2O2和 MDA 含量的改变来判断 NB 是否损伤 HK-2细胞。同时四环素可以减弱 NB 对 HK-2细胞的损害，因此四环素联合其他药物殺灭 NB 可能是肾结石患者的福音。

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（收稿日期：2021-04-06）