徐家豪，林静嫦，张舒宁，董思远，钟先峰，陈文胜，陈礼培

（佛山科学技术学院食品科学与工程学院，广东省传统发酵食品工程技术研究中心，广东省食品流通安全控制工程技术研究中心，佛山市酿造工程技术研究中心，佛山市农业生物制造工程技术研究中心，广东佛山 528231）

新会柑橘，又称茶枝柑，产自广东新会，是中国地理标志性产品，新会柑橘有丰富的苹果酸、维生素C、 糖类、类黄酮、柚皮苷等营养物质[1]，具有抗氧化、抗突变、抗癌等多种生物活性，对心脑血管系统疾病的发生具有一定预防作用[2]。新会柑橘果皮常被制作成陈皮，而其果肉则因味酸而较少被利用，当作废料处理，这种“留皮弃肉”的处理方式，造成了资源浪费，同时也造成了一定的环境污染[3]。

红茶是产量最多且消费最广的茶，占据了全球茶销量的80%[4]。由于其独特的香气、味道、颜色及有益健康的特性，红茶已成为最令人愉悦和受欢迎的饮品之一[5]。英德红茶是广东著名红茶，中国地理标志性产品，以其汤色红亮、香气浓郁而闻名[6]，受到国内外消费者的广泛青睐，其含有多酚类物质、茶黄素等活性成分[7]，具有抗氧化[8]，抑菌[9]，解毒抗癌[10]等功效。近年来，以红茶为原料研发的红茶菌饮料不断进入消费市场[11]。红茶菌饮料是一种起源于中国的传统发酵饮料[12,13]，以红茶糖水为原料，由醋酸菌、酵母菌和乳酸菌[14]组成共生菌群混合发酵而成[15]，不但保留了红茶本身的饮用价值，同时兼具独特的发酵风味和保健作用[16]。本研究以广东特产-新会柑橘和英德红茶为原料，利用红茶菌，通过添加柑橘汁混合发酵生产柑橘红茶菌饮料，并对柑橘红茶菌饮料发酵工艺进行探究。首先通过单因素试验，探究乳酸菌添加量、糖添加量、发酵温度和发酵时间对红茶菌饮料的影响，再通过响应面法优化柑橘红茶菌饮料发酵工艺，最终得到制备柑橘红茶菌饮料最优发酵工艺，以期为实现广东特色产品融合开发，提高新会柑橘和英德红茶附加值，拓宽其应用领域提供理论依据，也为柑橘红茶菌饮料研发提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

新会柑橘；红茶叶，购自茶里集团有限公司；蔗糖，福正东海食品有限公司；乳酸菌，本实验室筛选鉴定保藏的食品源乳酸菌菌株，制成菌粉备用；葡萄酒果酒酵母菌，购自安琪酵母有限公司；醋酸菌，适用于醋酸发酵，购自济宁玉园生物科技有限公司；福林酚、没食子酸、柠檬酸、碳酸钠、无水乙醇、无水碳酸钠，购自广州化学试剂公司；果胶酶（食品级），购自康达生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

7200型可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；LRH-150型生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；JYL-C93T型榨汁机，九阳股份有限公司；WAY-2WAJ型阿贝折光仪，上海力辰邦西仪器科技有限公司；GR60DA型全自动灭菌锅，致微仪器有限公司；FE28-Standard型pH计、ME104型电子天平（万分之一），梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 柑橘红茶菌饮料流程

1.3.2 操作要点

1.3.2.1 柑橘汁制备流程

根据娄明等[17]的制备方法制备柑橘汁。

1.3.2.2 糖茶水制备流程

根据茶里红茶品牌推荐的浸泡方法，取2包红茶包于500 mL沸水中浸泡3 min，浸泡完毕后，取出茶包，加入蔗糖（80 g/L)，再次煮沸10 min，进行灭菌处理[18]。

1.3.2.3 混合、调配

将柑橘汁和糖茶水按照1:1的比例混合，根据实验探究加入蔗糖调配初始糖量，得到柑橘果汁红茶液。

1.3.2.4 接种、发酵

在柑橘果汁红茶液中加入一定量的酵母菌粉、乳酸菌粉、醋酸菌粉，搅匀，置于32 ℃培养箱发酵，糖度和pH趋于稳定时发酵停止。

1.3.2.5 过滤、灭菌、装罐

发酵完后，取发酵液上清液，用8层纱布过滤，得澄清液体，调配糖度和酸度后，进行高温灭菌（100 ℃，10 min），冷却后，装罐，于4 ℃冷藏保存。

1.4 指标测定

1.4.1 pH测定

便携式/台式酸度计测量pH，参照GB/T 11165-2005的测定方法。

1.4.2 可溶性固形物测定

可溶性固形物测定，参照GB/T 12143-2008饮料通用分析方法。

1.4.3 柑橘红茶菌饮料感官评价

通过感官评价探究饮料的工艺条件。感官评价由10名经过感官评价训练、有经验的评定员，进行评定。根据分级测试评价的要求，从色泽、口感、风味、组织状态等4个方面对柑橘红茶菌饮料的品质进行评分，满分100分。柑橘红茶菌饮料的评定标准见表1。

表1 柑橘红茶菌饮料感官评价评分表Table 1 Sensory evaluation scale of citrus kombucha beverage

1.5 发酵工艺的确定

1.5.1 单因素试验

经文献调研可知，影响柑橘红茶菌发酵的主要因素有：发酵菌（酵母菌、醋酸菌、乳酸菌）比例[19]、蔗糖添加量[20,21]、发酵时间[22]和发酵温度[23]。这些因素能够影响微生物的生长及最终代谢产物，从而影响最终产品品质。pH反映了有机酸产生情况，同时影响着饮料风味[24]，感官评定能反映饮料的品质及风味；消耗的可溶性固形物水平反映了微生物的生长过程[19]，故本研究以pH、感官评定、可溶性固形物消耗量为响应值，通过单因素试验，确定单因素水平范围，然后利用Box-Behnken响应面优化方法探究各因素对柑橘红茶菌饮料的综合影响，以确定柑橘红茶菌饮料发酵的最优发酵工艺。

1.5.1.1 乳酸菌粉添加量

红茶菌主要由酵母菌、醋酸菌、乳酸菌组成。而乳酸菌可发酵糖类物质产生乳酸等多种有机酸，且具有促进营养物质吸收、增加人体有益菌群、抗氧化等多种益生功能。研究表明[22]，红茶菌中的乳酸菌不仅可以改善红茶菌饮料风味，且可以提高醋酸菌的存活率和产有机酸能力。鉴此，发酵菌比例选择，以乳酸菌添加量变化为主导，在自然pH值下，固定酵母菌、醋酸菌添加量分别为0.10%，固定初始糖量为15%，于28 ℃恒温生化培养箱发酵5 d。在乳酸菌粉添加量为0.20%、0.40%、0.60%、0.80%、1.00%的情况下，探究乳酸菌粉添加量对柑橘红茶菌饮料品质的影响。

1.5.1.2 蔗糖添加量

在自然pH值下，乳酸菌粉添加量为0.40%，于28 ℃恒温生化培养箱发酵5 d。分别加入蔗糖1.80、5.50、8.80、12.50、16.70 g于100 mL的柑橘果汁红茶菌发酵液中，调配成糖量分别为5%、10%、15%、20%、25%的样品，探究蔗糖添加量对柑橘红茶菌饮料品质的影响。

1.5.1.3 发酵温度

在自然pH值下，乳酸菌粉添加量为0.40%，初始糖量固定为15%，于恒温生化培养箱发酵5 d。柑橘果汁红茶菌发酵液分别放置于温度为24、28、32、36、40 ℃。探究发酵温度对柑橘红茶菌饮料品质的影响。

1.5.1.4 发酵时间

在自然pH值下，乳酸菌粉添加量为0.40%，初始糖量固定为15%。柑橘果汁红茶菌发酵液分别发酵1、2、3、4、5、6 d，探究发酵时间对柑橘红茶菌饮料品质的影响。

1.5.2 响应面试验设计

研究表明，在红茶菌饮料发酵过程中，pH反映了有机酸产生情况，同时也反映了红茶菌菌群活性，且对饮料风味影响较大[25]，鉴此，本研究在单因素试验结果基础上，使用Box-Benhnken试验设计，以柑橘红茶菌饮料pH值为响应值，探究乳酸菌粉添加量（A）、蔗糖添加量（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D），4个因素对柑橘红茶菌饮料发酵的影响，采用Box-Behnken模型进行四因素三水平试验设计，试验因素与水平如表2所示。

表2 响应面试验水平及因素Table 2 Response surface test level and factors

1.5.3 数据分析

实验数据采用 Microsoft Excel 2019和Design-Expert 8.0.6软件作数据分析，采用OriginPro 2018作图，每个试验重复3次及以上，结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 乳酸菌粉添加量对柑橘红茶菌饮料发酵的影响

红茶菌饮料的特点之一是有机酸含量丰富，而有机酸含量与pH值呈一定正相关性[26]。Coelho等[14]研究认为，红茶菌饮料的pH最佳范围是2.5～4.2。在此范围内，pH越低，有机酸越丰富，并对人体不会造成危害。红茶菌主要由醋酸菌、酵母、乳酸菌组成[27]。乳酸菌作为益生菌，具有抗氧化、改善肠道菌群等益生特性，它可利用糖类产生乳酸[28]，且能提高醋酸菌存活率和产有机酸能力[29]。在传统红茶菌饮料（醋酸菌和酵母发酵）的基础上添加乳酸菌，能影响菌群对碳水化合物的利用和菌体的生长，同时使得发酵过程中的代谢途径发生变化，导致代谢产物及其产量也有所不同。添加了乳酸菌的红茶菌饮料，能产生更多的健康有机酸，改善饮料风味，气味更加柔和，降低刺激酸味[30]，同时提高饮料益生功效。本研究结果如图2所示。随着乳酸菌粉添加量的增加，感官评价得分的趋势是先增加后下降，乳酸菌粉添加量为0.40%时，感官评价得分最高，为88.47分，此时的柑橘红茶菌饮料香气协调，茶味、果香味及酸味巧妙结合，滋味酸甜可口，色泽为橘黄色，澄清透明；乳酸菌粉添加量为0.40%时，红茶菌饮料pH最低，为3.44。乳酸菌添加量为0.40%和0.60%时，可溶性固形物的消耗值没有显著性差异（p＞0.05）。结合成本问题考虑，选择最佳乳酸菌添加量为0.40%。

2.1.2 蔗糖添加量对柑橘红茶菌饮料发酵的影响

蔗糖不仅可以作为红茶菌饮料发酵的碳源，还可以作为甜味剂来调节饮料口感的酸甜比。由图3可以看出，在一定范围内，感官评分会随着蔗糖添加量的增加而升高。但蔗糖添加量过大时，糖未完全消耗完，液体浑浊，香气带有略微的酒香和甜腻，滋味较涩，导致感官评分下降；而蔗糖添加量过少时使得饮料香气和滋味带有着茶涩味；蔗糖添加量在15%时，柑橘红茶菌饮料清澈透明，呈现橘黄色，香气酸甜，无酒味和涩味，此时感官评分最高，为86.7分；而随着蔗糖添加量的增加，pH值呈先下降后上升的趋势，可溶性固形物消耗量呈先上升后下降的趋势，当蔗糖添加量为15%时，pH值最低，为3.71；可溶性固形物消耗量最高，为11.77%，说明此时红茶菌代谢活力较强。因此，本研究蔗糖的最佳添加量选为15%。在发酵过程中，蔗糖是主要的碳源和能源，红茶菌利用蔗糖代谢原理是酵母通过转化酶将蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并通过糖酵解产生乙醇[31]，代谢产物作为醋酸菌和乳酸菌代谢产生有机酸的底物被利用，同时酵母也会合成易挥发的酸性酯类，和对发展康普茶香气非常重要的果味芳香化合物[32]，为柑橘红茶菌饮料提供风味，提升品质。因为醋酸菌不能直接利用蔗糖，而醋酸菌将酵母代谢产生的葡萄糖和乙醇转化为乙酸及其他有机酸[28]。

2.1.3 发酵时间对柑橘红茶菌饮料发酵的影响

柑橘红茶菌饮料发酵是三种菌混合发酵的相对复杂的体系，无法完全根据某一种菌的生长特性而设定对应的发酵时间。添加了乳酸菌的红茶菌饮料，发酵所需的时间会比传统红茶菌饮料的发酵所需的时间要短，促进了酵母和醋酸菌的代谢作用，也加快了对碳水化合物的利用[22]。通过初步测定发酵1 d到6 d的饮料指标变化，以找到合适的发酵时间。结果如图4所示，发酵时间在1 d时，液体较为浑浊，且颜色偏暗橘黄色，气味较不协调，有很淡的酒香味。而发酵在第5 d以上，液体较为澄清呈橘黄色，具有浓郁的茶涩味，酸甜味适宜但带有杂味。而发酵第4 d时，感官评价分值达到最大，为87.63分，此时柑橘红茶菌饮料呈澄清亮橘黄色溶液，酸甜味适宜，滋味和气味协调，同时饮料的pH最低，可溶性固形物消耗量最大。在发酵前期，有较充足的物质供微生物生长繁殖，其可充分利用蔗糖转化成有机酸[33]，致使发酵液pH下降。发酵4 d后pH值稍有上升，推测有机酸进行了转化或者与某些物质发生了反应[34]，致使有机酸含量略有降低，pH值稍有上升。由以上结果可知，柑橘红茶菌饮料发酵4 d时，pH为3.65，可溶性固形物的消耗值达12.23%，其品质较好。

2.1.4 发酵温度对柑橘红茶菌饮料发酵的影响

如图5所示，当发酵温度较低时，饮料风味带有微微酒味，香味比较淡同时滋味较涩，而发酵温度较高时，饮料的颜色呈暗黄色，液体中较为浑浊，口味较甜。发酵温度为32 ℃时，柑橘红茶菌饮料的感官评价分值最高，为87.80分，此时柑橘红茶菌饮料色泽呈橘黄色且清澈透明，酸甜适中，口感细腻润滑，气味协调柔和。发酵温度对菌种生长、产酸能力有一定影响。发酵温度在32 ℃时，可溶性固形物消耗最大，pH值最低。说明在发酵温度32 ℃时，红茶菌群处于一个活力较好的状态，能够充分利用糖类产生有机酸。这也基本在酵母菌（26～30 ℃）、醋酸菌（28～35 ℃）和乳酸菌（30～37 ℃）的最适生长温度内[35]。温度过低或过高时，不利于菌种生长繁殖，同时也降低了产酸能力[36]。根据Nguyen等[19]的研究，红茶菌饮料发酵工艺的正确选择是能够生产出健康有机酸含量较高的饮料，pH能反映有机酸含量。因此，从有机酸含量生成的角度，柑橘红茶菌饮料最佳发酵温度选为32 ℃。

表3 配方优化响应面试验结果与分析Table 3 Results and analysis of formula optimization by response surface method

2.2 响应面法优化设计与结果

根据单因素结果可知，柑橘红茶菌饮料发酵过程中，pH值与可溶性固形物消耗量的变化趋势相反，但基本保持了同步。研究表明，有机酸是红茶菌饮料独特风味的主要影响因素，而pH大小可以比较直观的反映有机酸含量[37]。结合成本考虑，本研究最终以pH值为响应指标，乳酸菌粉添加量、蔗糖浓度、发酵温度、发酵时间4个因素设计响应面试验，得到二次多项回归方程：Y=3.14-0.005833A-0.0075B+0.021C-0.027D+0.032AB-0.012AC-0.068AD+0.13BC-0.02BD+0.1CD+0.93A2+0.77B2+0.48C2+0.3D2

2.2.1 方差分析

对回归方程结果进行方差分析（表4）发现：响应面回归模型中F=80.68且p＜0.0001，说明试验中所采用的二次模型极为显著；失拟项F=4.46，p=0.0813＞0.05，则说明模型与纯误差之间的关联不显著，该模型具有较高可靠性；模型的决定系数R2为0.9878，说明模型具有较高显著性；同时调整决定系数AdjR2=0.9755，能够解释实验有97.55%符合模型，且预测相关系数Pred R2=0.9337，说明此实验模型与真实数据拟合程度良好，具有实践指导意义，由此可以用该模型分析和预测红茶菌制备的最优工艺条件。交互项BC、CD对pH值的影响显著（p＜0.05），二次项A2、B2、C2、D2对pH值的影响极显著（p＜0.01）。根据表中各个因素的F值，说明各变量对pH值影响大小顺序为：D（发酵时间）＞C（发酵温度）＞B（蔗糖添加量）＞A（乳酸菌粉添加量）。

表4 拟合回归方程的方差分析结果Table 4 Analysis of variance of regression equation

2.2.2 响应面交互作用分析

响应面图中，等高线越密集，响应面越陡峭，则说明该因素对结果的影响越显著[38,39]。由图6可知，BC和CD项的响应面比较陡峭，影响显著（p＜0.05）；且从等高线可以看出，BC和CD的等高线接近于椭圆形，说明两因素之间交互作用显著（p＜0.05），即蔗糖添加量和发酵温度之间、发酵温度和发酵时间之间的影响显著；而其他的因素等高线接近圆形，则说明交互作用不显著。回归方程模型的方差分析结果与响应面图反映的各因素之间的交互作用结果一致。

以上结果可知，以pH值为响应指标，在乳酸菌粉添加量、蔗糖添加量、发酵温度、发酵时间等因素共同作用下，柑橘红茶菌饮料最优发酵工艺为：乳酸菌粉添加量0.40%、蔗糖添加量15.04%、发酵温度31.89 ℃、发酵时间4.05 d，在此条件下模型预测的pH值为3.14。

2.3 最优工艺条件试验验证

结合生产所能实现的实际条件，取乳酸菌粉添加量0.40%、蔗糖添加量15%、发酵温度32 ℃、发酵时间4 d，进行柑橘红茶菌饮料发酵，三次重复，以验证响应面优化的预测结果。最后得柑橘红茶菌饮料pH值为3.14，感官评价分值为93.1分，可溶性固形物消耗量为12.30%，红茶菌饮料液体澄清，色泽呈浅亮的橘黄色，酸甜中带有着柑橘发酵的果香和微微的茶香。该值与模型预测结果基本一致，表明基于该响应面模型分析优化柑橘红茶菌饮料发酵工艺的方法可行。

3 结论

本研究以新会柑橘和英德红茶作为主要原料，以乳酸菌、醋酸菌和酵母菌为发酵剂，对柑橘红茶菌饮料发酵工艺进行了优化探究。通过单因素确定了乳酸菌粉添加量、蔗糖添加量、发酵温度及发酵时间，利用Box-Behnken响应面法对发酵工艺进行了优化，优化后的最佳发酵工艺条件为：乳酸菌粉添加量0.40%、蔗糖添加量15%、发酵温度32 ℃、发酵时间4 d，在此工艺条件下，得出柑橘红茶菌发酵液pH值为3.14、感官评价分值为93.1分、可溶性固形物消耗量为12.30%。本研究结果为提高英德红茶和新会柑橘的资源利用率及柑橘红茶菌饮料开发提供了理论依据及技术支持。