王猛，关思宇，于杰，薛金爱，狄建兵，王愈，姜进举，崔红利*，李润植*

（1.山西农业大学农学院分子农业与生物能源研究所，山西太谷 030801）（2.山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷 030801）（3.海藻活性物质国家重点实验室，山东青岛 266400）

氧化应激是机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧（Reactive oxygen species，ROS）过度积累，细胞氧化程度超出了氧化物的清除能力，氧化系统和抗氧化系统失衡，进而导致细胞衰老，造成组织损伤[1]。Harman等[2]研究表明，体内氧自由基反应失衡使得细胞富集大量ROS，进而加速细胞衰老。衰老是生命周期中必然经历的生理过程，衰老导致生物体自我更新能力和修复能力被削弱，此外，衰老常伴随多种慢性疾病的发生，如神经退行性疾病、癌症、糖尿病和心血管疾病等[3]。因此，当体内抗氧化酶难以抵挡自由基的过度富集，需要补充天然无毒的抗氧化剂来缓解细胞损伤。天然活性多糖因毒副作用小而备受关注。Feng等[4]研究证明，三七多糖虽对ROS的清除能力较弱，但是能显著延长线虫寿命，且该多糖对热应激的作用可能与提高抗氧化酶活性和降低脂质过氧化有关；潘子康[5]研究证明，小球藻多糖在抗氧化胁迫实验中提高了线虫的存活时间，提高了线虫耐热能力并且提高了线虫L4期的运动能力。

褐藻多糖（Fucoidan-containing sulfated polysaccharide，FSP）是褐藻细胞壁基质中的一种天然硫酸化多糖[6]。研究表明，FSP具有抗病毒、抗凝血、抗肿瘤、抗氧化、降血脂、调节免疫等多种生理活性[7,8]。先前研究表明，FSP是一种能够清除自由基和调节代谢的天然产物，这可能是由于多糖复杂的结构中带着不同数量的活性羟基和活性氢的缘故，这些活性基团特异性识别并配对单自由基，通过改变其结构达到清除自由基的作用[9]。Wang等[10]发现，不同藻类提取的FSP抗氧化能力也大不相同，且硫酸根含量与超氧阴离子自由基清除能力呈正相关；栗晓庆等[11]认为，通过碱提法获得的FSP自由基清除率高，还原力较弱，在体外表现出较强的抗氧化活性。此外，FSP抗氧化能力的关键是其分子量及硫酸根含量[12]。先前的研究多集中于体外验证，然而其体内验证及分子机制尚不明确。

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C.elegans）是一种存在于土壤中的食菌生物，因其生命周期短、易维护、可获得数千个突变株，被广泛用作研究抗氧化、抗衰老、抗阿尔兹海默症、抗糖尿病药物作用的模式生物[13]。胰岛素/类胰岛素样生长因子（Insulin/IGF-1，IIS）是调节生命周期且高度保守的信号通路，在线虫的发育、代谢和衰老过程中起关键作用[14]。研究表明，天然多糖通过调节某些信号通路中关键分子的表达，引起一系列级联反应，从而调控线虫的衰老[15]。Yuan等[16]证明地黄中性多糖通过IIS增强线虫的抗应激能力，从而延长线虫寿命；Zhang等[17]报道枸杞多糖主要通过sir-2.1、daf-12和daf-16延长了线虫的寿命。基于此，推测FSP通过调控Insulin/IGF-1信号通路增强线虫抵抗氧化应激的能力。目前，对FSP体外抗氧化研究较多，但是其抗氧化及抗衰老的机理研究鲜有报道。本研究以秀丽隐杆线虫为模式动物，研究FSP抗氧化性及其作用机理，为其作为天然食品开发利用提供数据支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验所用褐藻多糖（即岩藻多糖）FSP来自于裙带菜，由青岛明月海藻集团有限公司姜进举博士惠赠。FSP的化学组成如表1所示，其中，FSP的总糖和总蛋白的含量分别为70.4%和4.77%，糖醛酸含量为7.22%，硫酸基含量为21.5%，岩藻糖含量为63.38%。菌株购自美国线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center，CGC）：N2株系；Nematode Growth Medium（NGM）培养基，尿嘧啶缺陷型大肠杆菌（Escherichia coli）OP50，DPPH、抗坏血酸，磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH=7.8），Trizol试剂（上海生工），PrimeScript RT试剂盒（Takara），BCA蛋白试剂盒、SOD试剂盒、CAT试剂盒采购自南京建成生物技术公司。

表1 褐藻多糖化学组成Table 1 The chemical composition of FSP

1.2 方法

1.2.1 羟基自由基清除率的测定

在试管中加入0.5 mL不同浓度的FSP溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL）、0.5 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、0.5 mL 9 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液，混匀后加入0.5 mL 9 mmol/L的H2O2溶液，在37 ℃水浴中反应0.5 h后于510 nm处测定其吸光度值，Vc作为阳性对照。

式中：

A0——水代替样品测得的吸光度值；A1——多糖溶液测得的吸光度值；A2——乙醇代替水杨酸-乙醇溶液测得的吸光度值。

1.2.2 超氧阴离子清除率的测定

样液配制同1.2.1，向具塞玻璃试管中分别加入0.026 mol/L的甲硫氨酸1.5 mL，500 μL的磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH=7.8），然后加入300 μL的核黄素（0.02 mmol/L）和300 μL NBT（0.75 mmol/L），混匀后在光照下反应30 min，同时以蒸馏水作为空白对照A0，以不同浓度的Vc作为阳性对照，测定560 nm处的吸光值A，按照如下公式计算清除率。

1.2.3 总还原力测定

将1 mL不同浓度FSP（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL）放入2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH=6.6）中，与2.5 mL铁氰化钾（1%，m/V）混合，50 ℃反应20 min，然后加入2.5 mL三氯乙酸（10%，m/V）终止反应，5000 r/min离心10 min后取2.5 mL上清液与2.5 mL蒸馏水和0.5 mL FeCl3（0.1%，m/V）混合，静置10 min后于700 nm处测定各组吸光度值，Vc作为阳性对照。

1.2.4 FSP对线虫寿命及运动能力的影响

随机挑取20条同期化至L4期线虫分为4组，分别将其接种至不含或含有不同浓度FSP-L（50 μg/mL）、FSP-M（100 μg/mL）、FSP-H（200 μg/mL）的NGM培养基饲养（饲喂OP50，同时为防止排卵影响每天转板）。每组3次重复，每板20条，于恒温恒湿培养箱中培养，此时记为线虫寿命的第0 d。每天更换新鲜培养基，第2 d起，在显微镜下观察线虫存活状态，死亡标准以用picker轻碰线虫，线虫头部或身体不摆动弯曲为准，每天对各板中线虫死亡数详细记录，计算存活率；钻入培养基的线虫及由于其他因素死亡的线虫将从统计数据中排除，以生存率百分比为纵坐标绘制生存曲线。

线虫运动能力检测根据参考文献[18]。实验组各挑取状态相当的线虫放置在2%的琼脂糖凝胶上，先让线虫运动约两分钟适应环境，在体式显微镜下观察30 s内线虫头部的摆动次数并记录，用以评价线虫运动能力的指标。一次头部摆动是指线虫的头部呈弓形运动（每组检测线虫数目最少15条）。

1.2.5 脂褐素及细胞凋亡荧光检测

制作2%琼脂糖凝胶，倒在培养皿盖里，厚度大概控制在1～3 mm，凝固后，切下一小块琼脂放在载玻片上，将线虫挑在培养基上，于荧光显微镜激发485 nm、发射530 nm波长蓝光观察。

线虫细胞凋亡程度采用4',6-二脒基-2-苯基吲哚荧光染色法[19]（DAPI）测定：取线虫培养平板，切除2.0 cm×2.0 cm的琼脂，加入M9缓冲液低速离心后收集虫体。荧光检测前，将0.5 mol/L碳酸盐缓冲液与甘油等体积混合，pH=9.5，每个虫体样品避光染色10 min，用磷酸盐-生理盐水缓冲液冲洗3次，荧光显微镜激发360 nm、发射400 nm波长紫外光下镜检。

1.2.6 H2O2诱导的急性氧化应激

随机挑取30条同期化至L4期线虫分为4组，分别将其接种至不含或含有不同浓度FSP-L（50 μg/mL）、FSP-M（100 μg/mL）、FSP-H（200 μg/mL）的NGM培养基培养，将培养2 d后的线虫急性暴露于0.1% H2O2的48孔板内，每孔10条，每组三次重复，每隔30 min计数线虫的存活个数，绘制生存曲线，直至全部死亡。

1.2.7 抗氧化酶测定

按1.2.4寿命实验线虫培养方法，用3 mL磷酸盐缓冲液收集线虫至10 mL离心管，设置破碎功率和时间分别为800 W和8 min对线虫组织破碎，之后对破碎的组织液离心，离心后取上清[20]。按照BCA试剂盒测定蛋白浓度，SOD试剂盒和CAT试剂盒测定线虫酶活。

1.2.8 mRNA提取及荧光定量PCR检测

将同期化L4期线虫FSP处理后，培养2 d。收集虫体于离心管中，PBS缓冲液清洗3次。Trizol法提取线虫的总RNA，Primer 5.0设计相关基因引物。用SYBR Green为DNA荧光染料，实时荧光定量PCR测定，以β-actin为内参测定daf-16及其下游靶基因的表达量，基因表达以PCR的2-ΔΔCt值表示。

表2 秀丽隐杆线虫抗氧化基因实时定量PCR引物Table 2 Real time quantitative PCR primers for antioxidant genes of C. elegans

1.3 统计学分析

本文数据处理采用Graghpad Prism 5.0，p＜0.05表示差异显著。数据采用平均值±标准差（Mean±SD）表示，用One-way ANOVA进行处理，活力脂褐素以及DAPI荧光显微镜拍照，作图用Origin 9.1。

2 结果与分析

2.1 FSP对羟基自由基的清除作用

羟基自由基（·OH）是重要的活性氧之一，氧化能力强且危害性较大。因此，研究FSP对羟基自由基的清除作用是FSP抗氧化性研究中重要的部分。Fenton 反 应（Fe2++H2O2=·OH+OH-+Fe3+）产生·OH，·OH与水杨酸反应生成2,3-二羟基苯甲酸，该物质在510 nm处有一个特殊的吸收峰。研究表明，在体系中若加入抗氧化剂时，会产生的较少的·OH，吸光度降低[21]。本试验中通过Fenton法测定褐藻多糖对·OH清除效果，如图1所示。在0.1～0.5 mg/mL浓度时FSP对·OH清除作用呈显著的浓度依赖性，当FSP的浓度为0.5 mg/mL时，对羟基自由基的清除率是30.13%。FSP对羟基自由的清除活性低于张志东等[22]提取的从大连海域得到的褐藻多糖，当褐藻多糖浓度为0.6 mg/mL时，清除率达50%。

2.2 FSP对超氧阴离子自由基的清除作用

作为机体诱发脂质过氧化的原因之一，超氧阴离子自由基是氧化反应过程中最先产生的一种自由基。如图2所示，FSP具有清除超氧阴离子的能力，但相比于Vc，其清除率较低。在浓度为0.1～0.5 mg/mL内，FSP对超氧阴离子自由基的清除率呈剂量依赖性增加，并在0.5 mg/mL时，趋于平缓，清除率达41.13%。本实验研究结果，与王雪等[23]结果相似，羊栖菜褐藻糖胶超氧阴离子清除能力随多糖的浓度的增加而增强，但是此清除率低于其实验结果。

2.3 FSP的总还原力

所测样品将K3Fe(CN)6还原成K4Fe(CN)6，与Fe3+反应产生普鲁士蓝，在700 nm波长处检测普鲁士蓝的吸光度，吸光度值越高，样品的还原能力越强。如图3所示，在不同浓度下，所测样品的还原能力都很低。随着FSP浓度的增加，FSP的还原能力并未有显著变化，当多糖浓度为0.5 mg/mL时，在700 nm处，FSP最大吸光度也没有超过0.07，这一结果可能与实验所用多糖的含糖量有关。先前研究结果表明，随着吸光度不断增加，还原力逐渐增强，12 mg/mL的羊栖菜褐藻多糖的吸光度值为1.49。尽管本试验中多糖还原力较低，但我们也能发现吸光度值与多糖浓度呈正相关趋势[24]。

2.4 FSP对线虫寿命及运动能力的影响

在衰老过程中，机体细胞内环境稳态逐渐衰退，最终导致生命的终结。寿命长短作为抗衰老研究的定量指标，具有重要意义。如图4a所示，随着FSP浓度的增加，线虫存活曲线向右移，表明其最大寿命延长；图4b所示，与对照组相比，FSP干预后线虫的平均寿命显著（p＜0.05）提高，其中FSP-L、FSP-M和FSP-H组线虫的平均寿命较对照组分别延长了7.24%、26.70%和48.42%。综上，在一定浓度梯度内FSP显著（p＜0.05）延长了线虫的寿命。Zhang等[25]的研究结果表明，高剂量的毛竹多糖处理的线虫，平均寿命为27.3 d；张宗敏等[26]研究表明，与空白对照组相比，金钗石斛多糖显著延长秀丽隐杆线虫的平均寿命，质量浓度为0.24 mg/mL的多糖延长了33.89%。本研究发现FSP可以延长线虫寿命，且作用效果呈剂量依赖性，证明了摄食活性物质可以延长线虫寿命。

随着机体的衰老，运动能力也会减弱，头部摆动和身体弯曲频率常作为分析线虫运动能力的指标。为了探究FSP是否可以减缓因衰老所致的线虫运动能力下降，本实验选择线虫的头部摆动次数为评价指标。从表3中可看出，与CK相比，FSP干预后线虫的头部摆动次数显著增加，并呈现浓度依赖性。当给予FSP多糖浓度为50、100、200 μg/mL时，其运动能力比对照组分别增加了14.62%、35.52%和73.50%，每组之间均有显著（p＜0.05）差异。Gu等[27]研究黑木耳多糖对线虫生物学功能的影响中指出，0.8 mg/mL的黑木耳多糖能显著增加线虫的头部摆动频率，且线虫头部摆动与多糖浓度呈剂量依赖性，与本研究结果相一致。

表3 FSP对线虫运动能力的影响Table 3 Effect of FSP on the head swing of C. elegans

2.5 FSP对线虫体内脂褐素和细胞凋亡的影响

脂褐素[28]是线虫氧化应激和衰老的指示剂，是一种自发荧光色素，脂褐素含量随线虫年龄的增加而逐渐增加，过多的脂褐素沉淀会对线虫的机体造成损害，最终加速线虫的衰老。由图5可知，在线虫的同一时期，FSP处理组的线虫体内自发的荧光强度较对照组均有不同程度的降低，所以FSP可以减缓线虫体内脂褐素的积累，从而延缓线虫的衰老进程。DAPI染色常用于细胞凋亡检测[19]，细胞形态的变化如包膜褶皱或出泡，核染色质高度凝聚、边缘化等都可作为细胞凋亡的证据。DAPI染色结果表明，对照组中细胞核染色质高度聚集，形态改变，而FSP一定程度上缓解了细胞凋亡程度且呈剂量依赖性。有研究报道，青钱柳多糖在线虫生命周期的不同阶段均能显著降低年龄色素的积累[29]。张晓寒等[30]的研究表明，随着线虫生命的进程，机体衰老导致体内脂褐素堆积，根皮素能显著降低体内脂褐素含量，作用效果呈剂量依赖性，其中75 μg/mL的根皮素脂褐素水平较正常组降低了36.96%。Suetomi等[31]研究表明，在线虫衰老过程中，伴随着细胞失活，凋亡的细胞在DAPI染色后，呈现亮蓝色，天然的活性物质一定程度上会延缓衰老、缓解细胞凋亡程度，本研究结果表明，200 μg/mL的褐藻多糖能够缓解细胞凋亡程度。

2.6 FSP对线虫应激能力的影响

氧化应激被认为是诱发衰老的风险因素，线虫抵抗氧化应激能力与寿命密切相关，氧化应激会加速线虫的衰老甚至死亡，这可能是由于氧化剂引起的DNA损伤[32]。线虫寿命的延长与抗压能力的增强有关。为了全面评价FSP的抗逆性，测定了线虫对氧化应激的抗性。H2O2可产生羟基自由基，会促进细胞氧化损伤，所以选择0.1%的H2O2致线虫急性氧化应激。由图6可知，对照组在氧化应激3.5 h时，线虫已无存活，但是在4.5 h时，FSP-M、FSP-H组存活率还为3.3%和6.7%，经FSP处理后，生存曲线显著右移，线虫的平均寿命均显著（p＜0.05）增加，且与空白对照组相比分别增加了4.3%、37.2%、62%（表4）。先前研究表明，根皮素可有效保护线虫抵抗氧化应激的影响[30]，且75 μg/mL的根皮素处理后线虫平均寿命延长了35.96%。

表4 FSP对线虫氧化应激下寿命的影响Table 4 Effect of FSP on longevity of C. elegans under oxidative stress

2.7 FSP对线虫抗氧化酶活力的影响

抗氧化酶活性及含量直接影响了机体在氧化损伤中的免疫能力[33]。由图7可知，线虫体内SOD活性和CAT活性均与FSP浓度呈一定的剂量依赖效应关系。FSP显著（p＜0.05）增强了SOD和CAT活性。其中FSP-L、FSP-M、FSP-H分别提高SOD活力48.48%、75.91%和82.75%，CAT活性分别增强了58.26%、65.85%和74.95%。结果表明，FSP通过促进线虫体内抗氧化酶活性清除自由基。先前研究表明，南瓜多糖及其降解产物能显著提高SOD和CAT等抗应激相关的抗氧化酶活性[34]。Wang等[35]的结果表明，400 mg/mL的橘皮素能够显著（p＜0.05）提高抗氧化酶活性，与对照组相比，分别提高了2.9倍和2.2倍。本实验结果发现，200 μg/mL的FSP显著提高了CAT及SOD活性，与对照组相比分别提高了1.75倍和1.83倍。

2.8 FSP对线虫基因表达的影响

为了进一步检测FSP对线虫体内抗氧化分子机制，利用PCR技术对（图8）Insulin/IGF-1信号通路上关键因子进行分析。Insulin/IGF-1信号通路在调控线虫衰老中扮演着重要的角色[36]，该通路主要起调节作用的信号基因有daf-2、daf-16和skn-1[37]。在IIS中，转录因子daf-16是调控长寿的关键因子；而其上游基因daf-2可以负向调控该通路[38]，当daf-2的转录活性受到抑制时，daf-2下游的daf-16在细胞核内表达增加，从而达到抗压、延长寿命的效果[39]。此外，线虫转录因子skn-1也可以通过激活第二阶段的解毒反应来抵抗氧化应激，而且skn-1延长寿命的机制是独立于daf-16的[40]。本实验结果表明，经FSP处理后，线虫体内daf-2的基因表达较对照组显著（p＜0.05）下调，而daf-16和skn-1的基因表达显著（p＜0.05）升高，提示FSP通过下调daf-2基因和上调daf-16基因延长线虫的寿命。本研究结果与大多植物多糖抗衰老作用的机制相似[41]，FSP通过调节Insulin/IGF-1信号通路关键基因的表达进而调控线虫衰老。

3 结论

FSP已被证明具有多种生理活性且具有潜在的药用价值。以其抗氧化作用为例，本实验首先研究FSP体外抗氧化活性，随后研究其在体内抗氧化活性。本研究发现，FSP可有效延缓线虫寿命，提升线虫抗氧化酶活性，通过影响Insulin/IGF信号通路上关键基因表达进而参与了线虫衰老过程的调控。综上，本研究为FSP抗氧化研究提供实验依据，同时为天然抗氧化剂及抗衰老辅助因子的开发提供理论基础，但线虫氧化应激分子机制较为复杂，更深入的分子水平研究有待进一步开展。