成晓霞，李欣怡，李 微，李慧雯，何凤琴

(西安文理学院 生物与环境工程学院；西安市秦岭天然产物开发与抗癌类创新药物研究重点实验室；西安文理学院 基因工程实验室，西安 710065)

自由基是一类外层轨道含有未配对电子的原子、原子团或分子，生物体内的自由基过度积累会打破氧化还原平衡，过剩的自由基会导致蛋白质、核酸等生物大分子交联或断裂，破坏蛋白质构象或影响生物膜功能，进而引发细胞损伤、变性，最终走向死亡[1-2]．许多疾病的起源与发展均与体内自由基的过度积累有关，如皮肤衰老、血管硬化、线粒体异常、脑组织损伤、细胞癌变等[3-5]．因此，从天然产物中寻找安全、高效的抗氧化活性物质一直以来热度不减．目前，体外抗氧化活性评价常通过检测自由基清除能力、铁离子还原能力、氧自由基吸收能力等方式，其中DPPH法和ABTS法是通过抗氧化剂分别与紫色的DPPH乙醇溶液和蓝绿色ABTS溶液反应后，溶液颜色变淡，吸光度值下降程度与自由基清除能力正相关，从而间接体现物质总抗氧化能力，是目前使用最广泛的检测自由基清除能力的方法[6]．FRAP法则是利用抗氧化剂能够将Fe3+还原成Fe2+，并在593 nm处有强吸收,结果以标准抗氧化剂的相对浓度来表示，此法操作快速、简单、重复性好,是一种被研究者提倡的检测天然产物抗氧化活性的方法[7-8]．

大金发藓(PolytrichumcommuneL.ex Hedw)是藓纲、金发藓目(Ploytrichales)、金发藓科(Polytrichaceae)、金发藓属(PolytrichumHedw)植物，因其孢子体色黄且状如发丝而得名[9]．《本草纲目》及《中华本草》收录其全草入药，其味甘，性凉，主治久热不退、肺病咳嗽、盗汗、吐血、便血、崩漏、跌打损伤、子宫脱垂、刀伤出血[10-11]．近年来的研究表明，大金发藓中含有萜类、黄酮类、酚类及具有新颖结构骨架的苯并萘并呫吨酮类化合物及其衍生物、苯乙烯醛基并联苄化合物和苯乙烯基并二氢黄酮类化合物等[12-16]．大量研究证明黄酮、酚类化合物具有清除自由基的活性，与抗氧化能力密切相关[17-23]．因此，本研究通过评价大金发藓不同极性组分的抗氧化活性，并分析各组分内不同物质与抗氧化能力的相关性，旨在为大金发藓的合理开发和应用提供科学参考，也为靶向清除自由基活性产物的研发积累实验数据．

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

大金发藓地上全草于 2009 年 8 月采自陕西秦岭南麓平河梁(海拔 2305 m，33°27′ N，108°30′ E)，经陕西师范大学肖娅萍教授鉴定为大金发藓PolytrichumcommuneHedw，标本存于西安文理学院标本馆(NO.20090016)．

1.1.2 主要试剂

齐墩果酸(oleanolic acid，OA，天津西玛科技有限公司)，芦丁(Rutin，上海斯信生物科技有限公司)，没食子酸(Gallic acid，GA，sigma公司)，香草醛(天津市科密欧化学试剂有限公司)，BHT(二丁基羟基甲苯)、TPTZ(二硫代苏糖醇)、DPPH (1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、ABTS(2,2′-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)、福林酚试剂均购自Aldrich公司；95%乙醇、冰醋酸、高氯酸、碳酸钠、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、二甲基亚砜溶液、三氯化铁、盐酸、醋酸钠、过硫酸钾均购自天津市天力化学试剂有限公司．

1.1.3 仪器设备

旗舰多功能粉碎机(Q-500B，上海冰都电器有限公司)；电子天平(BT 125D，赛多利斯科学仪器北京有限公司)；高功率数控超声波清洗器(KH-400KDB，昆山禾创超声仪器有限公司)；循环水式多用真空泵(SHB-Ⅲ，上海科恒实业发展有限公司)；旋转蒸发器(R系列，上海申生科技有限公司)；数显恒温水浴锅(HH-4，常州普森电子仪器厂)；移液器(Pipetman Neo P200N、P1000N，吉尔逊实验仪器(上海)有限公司)；可见光分光光度计(722 s，上海棱光技术有限公司)；吸收光酶标仪(EUX800，基因有限公司)．

1.2 方法

1.2.1 大金发藓提取物制备

称取大金发藓粉末400 g，加入体积分数为80%的1.2 L乙醇，在功率为400 W的超声下提取30 min，真空抽滤，残渣加入体积分数为90%的乙醇1.2 L，重复超声提取，条件同前．收集合并上述两次提取液，挥干有机溶剂后得醇提浸膏，将浸膏用蒸馏水混悬，依次分别用极性逐渐增加的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，得到石油醚萃取液、氯仿萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液，分别挥干有机溶剂得到极性由小到大的不同组分样品，称重，计算得率．

1.2.2 大金发藓提取物含量测定

1.2.2.1 萜类含量测定 ①精确称取齐墩果酸用乙醇溶解，配制0.803 6 mg/mL标准品溶液；②将5 g香草醛溶于冰醋酸，定容到100 mL，制备5%香草醛-冰醋酸溶液；③取待测样品0.2 mL挥干后加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸和0.8 mL高氯酸，摇匀后70℃反应15 min，冰水浴10 min，加入5 mL冰醋酸，摇匀静置10 min，测定550 nm的溶液吸光度。

1.2.2.2 黄酮含量测定 ①精确称取芦丁用乙醇溶解，配制0.991 8 mg/mL标准品溶液；②分别将5 g亚硝酸钠、10 g硝酸铝、4 g氢氧化钠溶于蒸馏水，定容到100 mL，制备5%亚硝酸钠溶液、10%硝酸铝溶液、4%氢氧化钠溶液；③取样品0.6 mL与70%乙醇混合至2 mL，加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀静置5 min，然后加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀静置6 min，最后加入4% 氢氧化钠溶液3 mL，摇匀静置15 min，测定510 nm的溶液吸光度。

1.2.2.3 总酚含量测定 ①精确称取没食子酸溶于超纯水，制备0.256 mg/mL标准品溶液；②将20 g碳酸钠溶于纯水，定容至100 mL，制备20%碳酸钠溶液；③取样品0.2 mL与70%乙醇混合至1 mL，加入20%碳酸钠溶液1.5 mL，混匀后加0.5 mL福林酚试剂，最后加纯水2 mL混匀反应1h后测定760 nm的溶液吸光度。

1.2.3 抗氧化活性评价

1.2.3.1 DPPH法 ①试剂配制：用无水乙醇配制浓度为0.024 mg/mL的DPPH溶液；②样品检测：将 DPPH溶液与待测样品或标准品(BHT)等比例混合均匀，避光振摇5 min后静置15 min，于517 nm波长处测定吸光度值；③BHT作为阳性对照，以不同浓度的BHT溶液为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，用待测样品的吸光度平均值进行换算，所得结果以BHT当量代表其抗氧化能力．

1.2.3.2 ABTS法 ①试剂配制：用PBS溶液分别配制浓度为3.841 mg/mL的ABTS溶液和0.662 mg/mL的过硫酸钾溶液，将上述两种溶液按照等比例混合摇匀，室温避光反应12～16 h，制成ABTS储备液，将储备液与pH 7.0～7.2 的PBS溶液以1∶19比例混匀作为ABTS工作液；③样品检测：将等体积ABTS工作液与待测样品或标准品(BHT)混合均匀，室温条件下于90 min内测定734 nm波长处的吸光度值；④BHT作为阳性对照，以不同浓度的BHT溶液为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，用待测样品的吸光度平均值进行换算，所得结果以BHT当量代表其抗氧化能力．

1.2.3.3 FRAP法 ①试剂配制：称取1.23 g醋酸钠溶解于50 mL蒸馏水中配成300 mM醋酸钠溶液，称取0.015 6 g TPTZ溶解于5 mL 40 mM的盐酸中配成10 mM TPTZ溶液，称取0.027 g三氯化铁溶解于5 mL蒸馏水中配制成20 mM三氯化铁溶液，取上述3种溶液按照10∶1∶1的比例混合摇匀，于37℃水浴3 min；②样品检测：向3 mL FARP工作液中加入0.1 mL待测样品或标准品(BHT)混合均匀，于室温45～135 min内在593 nm波长处测定吸光度值；③BHT作为阳性对照，以不同浓度的BHT溶液为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，用待测样品的吸光度平均值进行换算，所得结果以BHT当量代表其抗氧化能力．

1.2.4 数据处理

2 结果与讨论

2.1 大金发藓极性组分含量分析

分别以不同浓度的齐墩果酸、芦丁、没食子酸标准品为横坐标，测定不同浓度标准品的吸光度值为纵坐标，绘制萜类、黄酮和酚类物质的标准曲线，得到的线性回归方程如表1所示．分别测定不同样品的吸光度值，参考表1的回归方程，换算大金发藓各极性组分的含量结果见图1.

表1 不同活性物质组分的标准曲线

图1 大金发藓极性组分的含量测定

由图可知，石油醚组分中各活性物质含量由高到低的顺序为：三萜>黄酮>总酚；氯仿组分中各活性物质含量由高到低的顺序为：三萜>黄酮>总酚；乙酸乙酯组分中各活性物质含量由高到低的顺序为：三萜>黄酮>总酚；水饱和正丁醇组分中各活性物质含量由高到低的顺序为：三萜>黄酮>总酚．整体来说，不同的极性组分中都含有三萜、黄酮、总酚等活性物质，且各组分中的三萜含量最高，黄酮含量次之，总酚含量最低．

2.2 大金发藓抗氧化活性评价

本实验采用食品加工领域中常用的抗氧化剂BHT(butylated hydroxytoluene) 作为标准对照品，其化学名称为2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，分子式：C15H24O，稳定性较好．通过DPPH、ABTS、FRAP方法分别测定不同浓度标准品的吸光度值，以BHT浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，拟合回归方程如表2所示，用相同方法测定大金发藓四个极性组分在不同浓度下的吸光度值，依据表2换算为不同BHT当量，体现其抗氧化能力，结果见图2～图4．

图4 FRAP法测定大金发藓不同极性组分的抗氧化能力不同字母表示组间差异显著(P<0.05)

表2 不同抗氧化评价方法的标准曲线

图2 DPPH法测定大金发藓不同极性组分的抗氧化能力不同字母表示组间差异显著(P<0.05)

运用DPPH法对大金发藓四种极性组分的抗氧化能力进行测定，结果见图2，大金发藓中石油醚组分、乙酸乙酯组分、氯仿组分和正丁醇组分的BHT当量分别为0.575±0.064、1.561±0.041、0.610±0.172、1.536±0.028 mg/mL．大金发藓中乙酸乙酯组分和正丁醇组分抗氧化能力明显高于石油醚组分和氯仿组分(P<0.05)，依据DPPH法的结果，大金发藓各组分的抗氧化能力依次为乙酸乙酯组分>正丁醇组分>氯仿组分>石油醚组分．

运用ABTS法对大金发藓四种极性组分的抗氧化能力进行测定，结果见图3，大金发藓中石油醚组分、乙酸乙酯组分、氯仿组分和正丁醇组分的BHT当量分别为0.826±0.062、0.968±0.004、0.743±0.137、0.953±0.035 mg/mL．大金发藓中乙酸乙酯组分和正丁醇组分抗氧化能力明显高于石油醚组分和氯仿组分(P<0.05)，依据ABTS法的结果，大金发藓各组分的抗氧化能力依次为乙酸乙酯组分>正丁醇组分>石油醚组分>氯仿组分．

图3 ABTS法测定大金发藓不同极性组分的抗氧化能力不同字母表示组间差异显著(P<0.05)

运用FRAP法对大金发藓四种极性组分的抗氧化能力进行测定，结果见图4，大金发藓中石油醚组分、乙酸乙酯组分、氯仿组分和正丁醇组分的BHT当量分别为0.490±0.038、2.155±0.123、0.987±0.110、1.104±0.167 mg/mL．大金发藓中乙酸乙酯组分抗氧化能力明显高于其他三个组分(P<0.05)，正丁醇组分和氯仿组分的抗氧化能力相当，均略高于石油醚组分，依据FRAP法的结果，大金发藓各组分的抗氧化能力依次为乙酸乙酯组分>正丁醇组分>氯仿组分>石油醚组分．

综上所述，大金发藓四个极性组分均具有DPPH•清除能力、阳离子自由基清除能力(ABTS+)和对Fe3+的还原力(FRAP)等抗氧化活性，其中乙酸乙酯组分具有最强的抗氧化活性，正丁醇组分次之，氯仿组分和石油醚组分的抗氧化能力均低于前两个组分．

2.3 大金发藓极性组分中各活性成分与抗氧化能力相关性分析

分别将大金发藓四个极性组分中各成分的含量与抗氧化能力进行相关性分析，结果如表3～表6所示．

表3 大金发藓石油醚组分活性物质与抗氧化能力相关性分析

大金发藓石油醚组分各活性成分和抗氧化能力的相关性分析结果如表3所示，用3种不同的方法检测，石油醚组分中的三萜含量与其抗氧化活性均有显著相关性(P<0.05)；黄酮与DPPH•清除能力极显著相关(P<0.01)，与阳离子自由基清除能力显著性相关(P<0.05)，却未表现出对Fe3+的还原力；总酚的含量与还原Fe3+的能力极显著相关(P<0.01)，并能显著影响清除阳离子的能力(P<0.05)，却并不能影响DPPH•清除能力．

大金发藓氯仿组分各活性成分和抗氧化能力的相关性分析结果如表4所示，三萜的含量可对阳离子的清除能力产生极显著影响(P<0.01)，同时也可显著影响DPPH•清除能力和对Fe3+的还原能力(P<0.05)；黄酮的含量可对Fe3+的还原能力产生极显著影响(P<0.01)，并与阳离子自由基清除能力显著性相关(P<0.05)，却未表现出DPPH•清除能力；总酚的含量与阳离子清除能力密切相关(P<0.01)，同时对DPPH•清除能力和Fe3+的还原力产生显著影响(P<0.05)．

表4 大金发藓氯仿组分活性物质与抗氧化能力相关性分析

大金发藓乙酸乙酯组分各活性成分和抗氧化能力的相关性分析结果见表5，三萜和总酚的含量均可显著影响DPPH•、阳离子自由基清除能力和对Fe3+的还原力(P<0.05)；黄酮与DPPH•和阳离子自由基清除能力极显著相关(P<0.01)，却未表现出对Fe3+的还原力．

表5 大金发藓乙酸乙酯组分活性物质与抗氧化能力相关性分析

大金发藓正丁醇组分各活性成分和抗氧化能力的相关性分析结果见表6，三萜的含量可对Fe3+的还原力产生极显著影响(P<0.01)，并与DPPH•、阳离子自由基清除能力呈显著性相关(P<0.05)；黄酮的含量仅可影响DPPH•清除能力(P<0.05)，却与阳离子自由基清除能力和对Fe3+的还原力无关；总酚的含量可显著影响清除阳离子与还原Fe3+的能力(P<0.05)，却并不能影响DPPH•清除能力．

表6 大金发藓正丁醇组分活性物质与抗氧化能力相关性分析

2.4 大金发藓不同活性成分与抗氧化能力相关性分析

根据大金发藓不同极性组分的抗氧化能力排序进行加权，乙酸乙酯组分、正丁醇组分、氯仿组分和石油醚组分的权重分别为4、3、2、1，每个组中出现极显著相关性(P<0.01，用“★★”表示)的可得到对应的权重系数，加和的系数总量与抗氧化能力呈正相关，综合表3～表6的数据，绘制表7如下．

表7 大金发藓活性成分与抗氧化能力相关性分析

由表7综合分析可知，大金发藓中的黄酮类化合物对清除DPPH•和阳离子自由基，以及还原Fe3+表现出极强活力，是大金发藓抗氧化的主力军．同时，大金发藓中的三萜类物质也表现出了较好的抗氧化能力，其与阳离子自由基的清除和对Fe3+的还原密切相关，此前的研究提示萜类物质具有抗肿瘤的活性，结合这两者可推测氧化应激与癌症发生的潜在联系．而大金发藓中的酚类物质虽也能表现出一定的抗氧化能力，但活性不及其他两种成分．

3 结论

通过DPPH、ABTS和FRAP这三种不同的方法，考察了分别含有三萜、黄酮和酚类的大金发藓石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇组分对DPPH•、阳离子自由基的清除能力，以及对Fe3+的还原能力．结果表明，大金发藓的乙酸乙酯组分表现出最强的体外抗氧化活性．同时，研究结果也证明黄酮类化合物是大金发藓中贡献主要抗氧化能力的活性组分．综上，建议以大金发藓乙酸乙酯组分的黄酮类化合物作为重点研发抗氧化类产品的目标组分，优化提取工艺并展开相关作用机制的探究，为大金发藓的合理利用、深度开发积累数据，为靶向氧化应激调控的相关产品研发提供参考．