赵 香 魏晓丽 李晓辉 佳木斯大学附属第一医院，黑龙江省佳木斯市 154000

中耳胆脂瘤是一种具有破坏性的非癌性病变，以角化鳞状上皮异常生长为特性[1]，由囊性成分、基质和基质周组织组成。中耳胆脂瘤最重要和最具破坏性的特征是进行性的骨质破坏，造成一系列颅内外并发症。中耳胆脂瘤的骨质破坏机制主要有破骨细胞(Osteoclast，OC)活化、压力坏死、酸溶解、酶介导、炎症介质作用等[2]。大多数研究认为，在中耳胆脂瘤的骨质破坏过程中，OC起到终末功能细胞的作用，破骨细胞活化因子(Receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)在OC的激活和成熟过程中起着尤为关键的作用[2]。有研究表明，蛋白磷酸酶2A(Protein phosphatase 2A，PP2A)可通过激活RANKL诱导的NF-κB信号通路，促进OC的生成和相关表达[3]。多项研究还证明，PP2A的异常表达与多种溶骨性疾病密切相关，如假体周围骨溶解、肺癌及乳腺癌等。故本文选取PP2A来作为切入点，分析与胆脂瘤骨质破坏存在的联系。

1 资料和方法

1.1 一般资料 30例胆脂瘤组标本取自2019年9月—2020年10月我院耳鼻咽喉科行乳突根治术或中耳探查术患者。其中男13例，女17例，年龄22～64岁，平均年龄49.83岁，病程6个月～50年。所选患者术后均病理诊断为中耳胆脂瘤。同时，手术中取15例患者耳后切口处正常皮肤作为对照组，其中男7例，女8例，年龄22～64岁，平均年龄45.27岁，病程6个月～50年。依据Hamed评分法将胆脂瘤组分为骨破坏组16例(得分≥4分)和未破坏组14例(得分0～3分)。

1.2 试剂 兔抗人PP2A单克隆抗体，免疫组化实验PV-8000-Vision试剂盒，DAB显色试剂盒。

1.3 主要方法

1.3.1 石蜡切片制备：所有标本取材后2h内固定(10%的中性福尔马林溶液)，脱水(梯度乙醇)，透明(二甲苯)，浸蜡，包埋；放置于4℃恒温冰箱中冷藏待用。后期使用切片机以4μm厚度切片；烤片，制得石蜡切片。

1.3.2 免疫组织化学：将石蜡切片浸入二甲苯脱蜡，再浸入梯度乙醇水化，蒸馏水冲洗，PBS液冲洗；柠檬酸高温高压修复3min，待切片自然冷却后，PBS冲洗；3%过氧化氢去离子水孵育15min，PBS冲洗；放湿盒画圈(保持不干片，边画边用PBS液冲洗)，甩干擦净后滴加山羊血清，室温孵育30min，倾去，勿洗；滴加一抗(工作浓度为1∶100)，放入37℃烤箱2h；取出切片置于室温10min后 PBS冲洗；滴加二抗，室温孵育20min，PBS冲洗；滴加新鲜配制的DAB显色液，在显微镜下控制背景，显色3min左右；放入蒸馏水中终止染色，用自来水充分冲洗；苏木素复染15min，自来水冲洗；分化，自来水冲洗5min；返蓝(EDTA液)10min；自来水冲洗，行梯度乙醇脱水，烤片，二甲苯透明，中性树胶封片。上述步骤中用已知阳性切片作为阳性对照，用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，以排除非特异性着色。

1.4 结果判定 将胆脂瘤上皮和正常耳后皮肤上皮层分为基底层、 颗粒层、 棘细胞层与角质层。以细胞中出现棕黄色颗粒且染色强度高于背景非特异性染色者为阳性标准。评分方法：先按染色强度计分，0分为无染色，1分为弱棕黄色，2分为中等强度棕黄色，3分为深棕色；然后每张切片在400倍显微镜下随机选取5个不重叠视野进行阳性细胞计数，每个视野计数100个细胞，计算5个视野的阳性细胞的平均百分比，按照百分比计分，没有细胞着色为0分，<20%细胞着色为1分，21%≤细胞着色≤50%细胞着色为2分，>50%细胞着色为3分；两项得分结果相加后分为四级：0、1为(-)，2为弱阳性(+)，3为阳性(++)，≥4为强阳性(+++)。

1.5 统计学方法 应用SPSS17.0统计分析软件对所得的实验数据进行分析，阳性率的比较采用χ2检验，等级资料的差异用秩和检验，P<0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PP2A在胆脂瘤组和对照组的表达情况 胆脂瘤组中PP2A分布于中耳胆脂瘤上皮全层，无明显强弱趋势，主要表达于细胞核，少数表达于细胞膜、细胞质(见图1)，阳性表达以强阳性和中阳性居多，阳性率为83.3%。而在对照组中PP2A多为阴性表达(见图2)，阳性率仅为26.7%。两组间差异具有统计学意义(χ2=11.650，P<0.01)，见表1。

图1 PP2A在中耳胆脂瘤中的表达(IHC ×400) 图2 PP2A在正常皮肤中表达(IHC ×400)

表1 胆脂瘤组和对照组PP2A的表达

2.2 PP2A在骨破坏组及未破坏组中的表达情况 骨质破坏组和未破坏组PP2A表达水平见表2，16例骨破坏组中PP2A表达强阳性者有10例，而14例未破坏组中仅有1例PP2A强阳性表达，骨破坏组中PP2A表达水平较未破坏组明显增强，两组间差异有统计学意义(P<0.01)。

3 讨论

表2 骨破坏组和未破坏组PP2A的表达

中耳胆脂瘤其危险性主要是对骨质的广泛破坏。研究表明，破骨细胞的浸润程度与中耳胆脂瘤的骨质破坏程度呈正相关，破骨细胞在骨质破坏过程中作为末端效应细胞，通过RANKL诱导的NF-κB信号通路而被激活[4]。

近年来，多项研究表明，PP也参与了胆脂瘤的形成。在体外实验中发现，PP2A不仅参与了细胞增殖及凋亡、蛋白质翻译及翻译后修饰、癌基因转化等细胞活动过程，还和肿瘤等多种疾病的发生发展有关[5]。Wang等[3]研究发现，PP2A在人假体周围膜和鼠钛颗粒诱导的骨溶解模型中高度表达，抑制PP2A表达可通过强烈阻断RANKL诱导的NF-кB信号通路抑制破骨细胞生成和破骨细胞相关表达，减轻骨质破坏。Okamura H等[6]研究发现，在体外培养基中，PP2A可通过调节成骨细胞中RANKL的表达参与破骨细胞形成。另外，Ricarte FR等[7]在体外实验中发现甲状旁腺激素及其类似物可通过PP2A信号调节成骨细胞中RANKL的表达。

本文结果显示，与正常耳后皮肤相比，PP2A在中耳胆脂瘤上皮呈现中高表达。此外，笔者通过对中耳胆脂瘤骨破坏组和未破坏组PP2A表达水平的统计学分析发现，PP2A在胆脂瘤上皮骨破坏组中阳性表达要高于未破坏组，这说明PP2A很有可能参与了中耳胆脂瘤的骨质破坏过程。结合以往的研究与本实验的结果笔者推测，在中耳胆脂瘤中，PTHrP高表达可能是引起PP2A高表达的原因之一。此外，PP2A水平的升高可能引起了RANKL的高表达，激活了NF-κB信号通路，促进OC的生成和相关表达，导致胆脂瘤周边的骨质受到破坏。另外，多项研究证明，PP2A是一种肿瘤抑制因子，其表达降低或失活是肿瘤转化的特征[6]。

综上所述，PP2A在中耳胆脂瘤中高表达并且极有可能参与了胆脂瘤骨质破坏的过程，为研究中耳胆脂瘤骨质破坏机制提供了新的方向，为今后在中耳胆脂瘤中PP2A的研究奠定一定基础，同时，对研发胆脂瘤临床治疗药物有一定的意义。