刘娜 于江 李建达 张玉玉 杨灵芝 任素芳 丛雁芳

摘要：为了解猪链球菌2型菌株对昆明小鼠的致病性，并建立其感染昆明小鼠模型，本试验分别取2头疑似患链球菌病的病死猪脑组织、血液分别涂布于含5%胎牛血清的TSA固体培养基中进行细菌分离;并对分离获得的细菌进行形态观察、PCR鉴定、药物敏感性试验、小鼠致病性试验及组织病理切片观察。结果显示，分离菌为革兰氏阳性短链球菌，经PCR鉴定为猪链球菌2型，命名为LY株;药敏试验证实LY株对青霉素、红霉素、氯霉素、苯唑西林、环丙沙星、诺氟沙星敏感，对四环素、多粘菌素B、克林霉素不敏感;LY株对小鼠致死剂量为2.2×109cfu/只;组织病理切片观察发现小鼠肺脏、脾脏及心肌均出现不同程度的病变。本研究明确了山东省猪链球2型毒株的毒力，为疫苗候选菌株的筛选提供了理论依据。

关键词：猪链球菌2型;分离鉴定;小鼠;致病性

猪链球菌（Streptococcussuis）2型是一种能够引起人兽共患的病原菌，临床上主要引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症和突发死亡等症状[1，2]。根据猪链球菌荚膜抗原的多样性，可将猪链球菌分为35个血清型（1～34型及1/2型）[3，4]，其中主要致病血清型为1、2、7、9型[5，6]。1998年夏季在江苏省部分猪群暴发猪链球菌2型疾病，对人畜健康造成严重威胁[7]。2005年夏季四川省暴发猪链球菌2型疾病，造成人员伤亡[8]。该菌是一种革兰氏阳性菌，在自然界分布广泛，不仅可以引起猪，还可以引起人、马、牛、羊、禽等多种动物感染[9]。人感染猪链球菌与职业有密切关系，但未见人与人直接传染的报道[10]。该病多呈地方性流行，一年均可发生感染，但多暴发于4～11周龄的猪群[11，12]。

本研究于2019年从山东省某猪场送检的具有后肢跛行划水样症状的2头40日龄发病仔猪中分离并鉴定出猪链球菌2型菌株，通过药物敏感性试验确定其对药物的敏感性。由于猪体试验周期长、操作不方便、费用高、免疫抑制病等在攻毒试验中常常影响结果[13]，而小鼠作为动物模型费用低、操作简易，因此本研究采用昆明小鼠建立猪链球菌2型LY株感染动物模型，以确定临床分离株猪链球菌2型LY株致死剂量及毒力。

1材料与方法

1.1病料来源

病料采集于2019年山东省某猪场送检的临床症状疑似猪链球菌2型的2头40日龄发病仔猪，临床表现后肢跛行，死前有划水样症状。

1.2试验动物及主要试剂

昆明小鼠，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司;TaqDNA聚合酶、dNTP、DL2000DNAMarker等，购自宝生物工程（大连）有限公司;TSA培养基、TSB培养基，购自美国BD公司;药敏纸片，购自OXOID公司;链球菌细菌生化编码鉴定管，购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.3细菌的分离纯化

取病死猪血液、脑组织分别划线接种于含5%胎牛血清的TSA培养基，37℃培养18h，挑取菌落，进行革兰氏染色鉴定。继续传至第三代，挑取单菌落接种于7mL含5%胎牛血清的TSB培养基，37℃摇床180r/min培养8h。

1.4菌液PCR鉴定

取100μL菌液進行PCR鉴定，以CPS2J基因特异性引物（表1）进行扩增[14]，扩增目的片段为124bp。菌液PCR反应体系（25μL）：10×TaqBuffer（含Mg2+）2.5μL，dNTPs2.0μL，10μmol/L的上、下游引物各1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，无菌水15μL，DNA模板3μL。PCR反应程序：95℃预变性10min;95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，34个循环;72℃延伸10min。反应结束后，取5μLPCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳鉴定。

1.5生长曲线及OD600值与其活菌数相关性曲线的建立

挑取单菌落，接种于含5%胎牛血清的TSB培养液中，37℃摇床180r/min培养12h，作为种子液。取种子液1mL，加入99mLTSB培养液中，37℃、180r/min培养，分时取菌进行活菌计数和吸光度OD600的测定，建立生长曲线及OD600值与其活菌数的相关性曲线。

1.6药敏试验

采用药敏纸片法检测该细菌对临床常用青霉素、红霉素、氯霉素、苯唑西林、环丙沙星、诺氟沙星、四环素、多粘菌素B、克林霉素共9种药物的敏感性，具体试验方法按照说明书进行操作。

1.7攻毒菌液制备

挑取猪链球菌2型LY株冻干粉划线接种于TSA平板（5%胎牛血清），置于37℃培养箱中培养18～20h，作为F1代。挑取F2代单菌落，密集划线于TSA平板（5%胎牛血清），37℃培养14h，冲洗菌体后，根据吸光度OD600与活菌数的线性关系，计算菌液浓度，并稀释至所需浓度。

1.8小鼠致病性试验

将40只昆明小鼠随机分为4组，每组10只，其中3组分别腹腔注射1.1×1010、1.1×109、1.1×108cfu/mL不同梯度菌液0.2mL，另一组作为空白对照，腹腔注射PBS0.2mL，攻毒后连续观察7d。

1.9组织病理切片观察

分别将小鼠的心脏、脾脏、肺脏经4%甲醛溶液固定后，按照常规包埋，制备石蜡切片，HE染色，镜检观察。

2结果与分析

2.1发病仔猪剖检结果

2头发病仔猪均表现为间质性肺炎，并有纤维素性渗出，心肌内膜黏连，关节积液，胸腔积液，脾梗死（图1）。

2.2细菌形态特征

在含有5%胎牛血清的TSA平板上生长出大量透明、光滑、圆润的小菌落。挑取疑似菌落进行革兰氏染色，显微镜观察显示为革兰氏阳性菌，呈链状（图2）。

2.3PCR鉴定

取100μL菌液进行PCR鉴定，扩增条带与目的条带大小一致（图3）。

2.4生长曲线及OD600值与活菌数的相关性曲线的建立

2.4.1生长曲线的建立 如图4所示，猪链球菌2型LY株在TSB培养基中培养3h左右开始进入对数生长期，6～8h达到高峰，8h后活菌数逐渐下降，进入衰退期。

2.4.2活菌数与OD600值相关关系的建立 根据分时测定的活菌数和OD600值，在细菌生长迟缓期和对数期，活菌数和OD600值呈线性关系（图5），相关性表示为y=24.6590x-1.0761（R2=0.9967）。

2.5药敏试验

药敏试验结果（表2）显示，分离菌株LY株对青霉素、红霉素、氯霉素、苯唑西林、环丙沙星、诺氟沙星敏感，对四环素、多粘菌素B、克林霉素不敏感。

2.6小鼠致病性试验

小鼠致病性试验结果显示试验组小鼠表现出不同程度的精神萎靡，被毛糙乱。感染剂量为2.2×109cfu/只小鼠在24h内全部死亡;2.2×108cfu/只攻毒组在48h死亡4只;2.2×107cfu/只攻毒组在48h死亡1只;对照组小鼠状态良好（表3）。将死亡的小鼠剖检，取肺脏划线接种于TSA平板（5%胎牛血清），分离的细菌经形态观察、PCR鉴定，证明为猪链球菌2型菌株。

2.7组织病理切片观察

组织病理切片结果显示，肺部血管发生玻璃样变，血管壁增厚，肺泡腔中可见淡粉色浆液渗出（图6A）;脾脏红髓区域淋巴细胞大量减少，组织中还可见较多圆形空腔，空腔中有嗜碱性颗粒物（图6B）;心肌纤维间隙增宽，血管扩张，充满红细胞（图6C）。

3讨论与结论

猪链球菌是一种具有荚膜的革兰氏阳性菌，其中2型为35个血清型中最常见且毒力最强的血清型[15]。猪链球菌自然感染的部位为猪的上呼吸道，尤其是扁桃体和鼻腔[16]。

近年来，随着猪繁殖与呼吸綜合征（PRRS）和猪圆环病毒病（PCV）等免疫抑制性疾病的流行，导致猪链球菌病2型感染率上升，然而对猪链球菌2型的生长特性却鲜有报道[17]。本研究从发病仔猪的肺部病灶分离菌株，经细菌形态学和PCR鉴定为猪链球菌2型。通过液体培养的方法对猪链球菌2型LY株的生长曲线及OD600值进行测定，结果显示，猪链球菌2型LY株在TSB液体培养基（含5%胎牛血清）中37℃培养3h后进入对数生长期，在8h后进入衰减期。

猪链球菌2型的毒力、致病性和免疫性一直是研究者十分关心的问题，目前已有猪链球菌2型感染模型的报道[18-20]。本研究选用昆明小鼠作为动物试验模型，用分离的LY株进行攻毒，小鼠出现精神抑郁、食欲下降、死亡等症状，感染剂量为2.2×109cfu/只时小鼠死亡率为100%。对死亡小鼠进行组织病理切片观察，分别在肺脏、脾脏和心肌中发现不同程度的病变。

猪链球菌作为一种典型的革兰氏阳性菌，对各种抗菌药的抵抗力并不强。但由于日常生产中抗生素的滥用，导致大量耐药菌株的出现。通过药敏试验发现，本研究分离到的猪链球菌2型菌株对多粘菌素B和克林霉素完全耐药，对四环素轻度耐药，而对青霉素、红霉素、氯霉素、苯唑西林、环丙沙星、诺氟沙星敏感。本研究结果与邓智丹[21]、刘泽文[22]、徐引弟[23]等研究结果不完全相同，说明抗生素的普遍使用，造成临床上菌株的耐药性差异，进一步验证了在猪链球菌的防治过程中，药敏试验的重要性与必要性。

综上所述，本研究建立了猪链球菌2型生长曲线，明确了该菌的生长特性和毒力，为疫苗候选菌株的筛选提供了理论依据。