刘松 曹孟会 李芹梅 张天谣 李文祥 黄美娟 黄海泉

摘要：为探析绿萼凤仙花对低温胁迫的生理适应性，本研究在前期预试验基础上，以20℃为对照，分别在2℃和0℃处理0、12、24、48、72h，测定其细胞伤害率（CIR）、叶绿素和丙二醛（MDA）含量、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活性及脯氨酸（PRO）等渗透调节物质的含量等指标，并进行相关性分析，以期为绿萼凤仙花开发应用提供参考。结果表明，随温度的降低及胁迫时间的延长，低温胁迫对绿萼凤仙花的伤害程度不断加剧。2℃和0℃低温胁迫下，绿萼凤仙花的CIR及MDA、可溶性糖（SS）和可溶性蛋白（SP）含量均呈上升趋势，在胁迫72h时分别高于对照3.18倍和5.09倍、80.85%和2.31倍、1.02倍和1.24倍、2.39倍和4.93倍，差异极显著;POD活性、叶绿素含量呈下降趋势，在胁迫72h时分别显著低于对照43%和71%、53%和60%，差异极显著;SOD、CAT活性及PRO含量均随胁迫时间的延长呈先升高后降低趋势，温度越低，越快达到峰值。相关性分析结果表明，CIR、叶绿素含量、MDA含量、SP含量和POD活性可作为绿萼凤仙花耐寒性鉴定的主要指标，SOD和CAT活性、PRO和SS含量可作为辅助指标。综合来看，绿萼凤仙花对2℃低温具有一定的耐性，在0℃低温下生长受抑并表现出一定的寒害特征。本研究结果可为绿萼凤仙花的引种驯化、杂交育种及抗寒育种提供一定的理论依据。

关键词：绿萼凤仙花;低温胁迫;细胞伤害率;抗氧化生理指标;渗透调节物质;相关性分析

随着全球气候变化加剧，极端天气如极端高温、极端低温等气候事件频繁发生[1]。而温度是决定植物地理分布、影响其品质和生长发育的主要因素，因此，探究植物對低温和高温的适应性及生理机制具有重要意义和作用[2]。

低温胁迫会引起植物新陈代谢紊乱，通过探析植物对低温的生理响应来研究和评价其耐寒性是较常见的方法。Plazek等[3]发现抗寒植株在低温胁迫下的细胞膜变化比低温敏感植株小，电导率增幅小。低温胁迫下的细胞外结冰现象可使胞内水向胞外转移，从而导致细胞受到程度更为严重的渗透胁迫，电导率升高[4]。Airaki等[5]将辣椒叶片在8℃低温下胁迫1～3d发现低温胁迫使细胞膜脂质过氧化加重，诱导了氧化胁迫。为此，植物通过启动一系列抗氧化酶系统来清除细胞内的活性氧（ROS），从而减低氧化胁迫对其造成的伤害[6]。另外，低温胁迫下，植物体内也能积累更多渗透调节物质如脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白，从而增强其渗透调节能力，提高对逆境胁迫的耐受性[7，8]。

凤仙花属植物种类丰富，在我国分布范围广，因花型奇丽、颜色和形态多样性高，极具观赏价值，但目前在花卉园艺中开发利用的品种还较少。绿萼凤仙花（ImpatienschlorosepalaHand.Mazz.）为一年生或多年生草本花卉[9]，主要分布于贵州、广东、广西等地，常生于疏林溪旁或山谷水旁阴处[10]，具有低矮、分枝能力强、花大色艳、花期长、一年多次开花等特点，是可开发为园林地被植物的优良植物材料。因此，研究绿萼凤仙花在低温胁迫下的生理适应性，对其引种驯化和抗寒品种选育具有重要指导意义。

目前尚未见有关绿萼凤仙花对低温胁迫的生理响应的研究报道。因此，本研究在前期研究基础上，设置2℃和0℃两种低温处理，以20℃为对照，通过分析不同处理时间叶片中相关抗氧化生理指标的变化动态，探析绿萼凤仙花对低温胁迫的生理响应机制，以期为其开发利用提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

试验用绿萼凤仙花于2020年7月分株于西南林业大学树木园。2021年1月选取长势一致且健康的成年植株进行试验。

1.2试验方法

将所选绿萼凤仙花植株分别在20、2℃和0℃的光照培养箱内处理0、12、24、48、72h，以20℃为对照（CK），共计15个处理，每个处理3盆植株。选取当年生茎上的成熟叶洗净并擦干，用于测定相关指标，每次试验重复3次。

1.3生理指标及测定方法

1.3.1细胞伤害率（CIR） 参考Chen等[11]的方法进行测定，计算公式：

CIR（%）=[（R-CK）/（R0-CK）]×100。式中，R为组织杀死前外渗液的电导率值;R0为组织杀死后外渗液的电导率值;CK为处理0h的外渗液电导率值。

1.3.2叶绿素含量 采用直接浸提法进行测定[12]。

1.3.3抗氧化物酶活性和丙二醛（MDA）含量 MDA含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定，超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮蓝四唑（NBT）光还原法测定，过氧化物酶（POD）活性用愈创木酚法测定，过氧化氢酶（CAT）活性用过氧化氢还原法测定[13]。

1.3.4渗透调节物质含量 脯氨酸（PRO）含量采用酸性茚三酮法测定，可溶性糖（SS）含量用蒽酮比色法测定，可溶性蛋白（SP）含量用考马斯亮蓝G-250比色法测定[14]

1.4数据处理

用MicrosoftExcel2010进行数据处理和作图，用SPSS26.0软件进行多重比较（Duncan’s法）和Spearman相关分析。

2结果与分析

2.1低温胁迫对绿萼凤仙花细胞伤害率的影响

由图1可知，20℃条件下，CIR随处理时间延长缓慢上升，但上升幅度很小，处理72h的CIR仅11%。2℃低温下，48h内的CIR与对照相当，但48h后急剧上升，72h达到46%，显著高于对照。0℃低温下，CIR在处理后即急剧上升，至12h已上升至37%，之后增幅略缓，至72h达到67%，与其他两处理间差异显著（P<0.05）。可见，绿萼凤仙花的细胞伤害率受胁迫温度和时间的共同影响。

2.2低温胁迫对绿萼凤仙花叶绿素含量的影响

由图2可知，2℃和0℃低温处理显著降低绿萼凤仙花的叶绿素含量（P<0.05），但两种低温处理间差异不显著;低温胁迫12～48h内各温度处理的叶绿素含量无显著差异，至72h降至最低，分别低于CK（20℃）53%和60%。CK处理下，绿萼凤仙花叶片中的叶绿素含量波动较小，均在12～15μmol·g-1FW。

2.3低温胁迫对绿萼凤仙花叶片保护酶活性的影响

由图3A可知，除2℃胁迫12h的SOD活性与CK差异不显著外，两种低温胁迫均能使绿萼凤仙花SOD活性显著升高（P<0.05），且2℃处理的SOD活性显著高于0℃处理;随胁迫时间延长，2℃和0℃处理的SOD活性先升高，并分别于24、12h达到最高值，之后逐渐下降，72h時仍显著高于CK57%和31%。CK处理的绿萼凤仙花SOD活性在72h内呈下降趋势，但降幅很小，为0.89%～17.86%。

与CK相比，0℃低温胁迫显著降低绿萼凤仙花的POD活性，且随胁迫时间的延长呈逐渐降低趋势，至72h时低于CK71%;2℃低温胁迫下48h内的POD活性与CK差异不显著，呈先升后降变化趋势，72h时大幅降低，显著低于CK43%（P<0.05）。CK的POD活性在72h内呈缓慢下降后又缓慢上升状态，降幅为0.43%～16.52%，处理48h的值最低（图3B）。

处理0～12h，2℃和0℃低温处理对绿萼凤仙花CAT活性的影响与CK无显著差异，但均在24h显著提高CAT活性，达到峰值;处理48h时，两低温处理的CAT活性仍高于CK，其中2℃处理仍显著高于CK;至72h，两低温处理的CAT活性分别低于CK10%和53%，其中，0℃处理与CK间差异显著（P<0.05）。两低温处理间比较，0～12h两者间CAT活性无显著差异，24～72h0℃处理的CAT活性显著低于2℃处理（P<0.05）。20℃条件下，处理72h内绿萼凤仙花的CAT活性为1.09～1.23U·g-1FW，呈小幅上升趋势（图3C）。

2.4低温胁迫对绿萼凤仙花叶片MDA含量的影响

由图4可知，2℃和0℃低温处理能够促进绿萼凤仙花的MDA积累，且积累量随处理时间的延长而增加。2℃条件下处理72h的积累量显著高于CK80.85%;而0℃条件下处理12h的积累量即显著高于CK（P<0.05），72h时则高于CK2.31倍。CK处理的MDA含量变化很小，在1.28～1.41μmol·g-1FW范围内波动。

2.5低温胁迫对绿萼凤仙花叶片细胞渗透调节物质含量的影响

由图5A可知，2℃胁迫12～72h的PRO含量均高于CK，并在胁迫24h后达到差异显著水平;0℃胁迫12～24h的PRO含量显著高于CK，之后逐渐下降，72h时略低于CK，差异不显著。随胁迫时间的延长，2℃和0℃处理的PRO含量均先升高后下降，分别于处理48h和12h达到峰值。CK的PRO含量在72内无明显变化，稳定在13～14μg·g-1。

由图5B可知，2℃胁迫0～72h的SS含量先下降后上升，24h时最低，显著低于CK24.31%，48～72h则显著高于CK，尤其72h时，比CK高1.02倍;0℃处理下，随胁迫时间的延长，SS含量呈先上升后下降再上升的变化趋势，12～24h显著高于CK，48h时则显著低于CK，之后快速上升，72h时显著高于对照1.24倍。CK的SS含量在0～72h内先降低后上升，在218～255μmol·g-1FW范围内小幅变化。

由图5C可知，低温胁迫能够增加绿萼凤仙花叶片中的SP含量，2℃处理48h后差异达显著水平（P<0.05），尤其处理72h时达到CK的3.39倍;0℃条件使SP含量在处理12h时即显著高于CK，之后随处理时间延长逐渐升高，24h后增幅加大，72h时达到CK的5.93倍。CK的SP含量在处理的72h内变化很小，保持在5.4～6.9μmol·g-1FW。

2.6绿萼凤仙花叶片各项生理指标的相关性分析

由表1可知，CIR与胁迫时间始终呈极显著正相关，表现为随着胁迫时间的延长显著上升，且温度越低，两者的相关性越高。2℃和0℃低温胁迫下，CIR与SP和MDA含量一直呈极显著正相关，与叶绿素含量呈极显著负相关;POD在2℃低温下与CIR显著相关，在0℃下则与CIR极显著相关;PRO在2℃低温下与CIR呈现极显著正相关;SS和CAT在2℃和0℃低温胁迫下与CIR相关不显著。表明MDA、SP和叶绿素含量及POD活性在绿萼凤仙花受低温胁迫的不同阶段对细胞损伤进行有规律的响应，而SOD和CAT活性及PRO和SS含量对绿萼凤仙花响应低温胁迫无明显规律。

3讨论

膜系统在植物抵御低温冷害中起重要作用，冷害会使植物体内产生大量的活性氧，导致细胞膜脂过氧化，增加细胞膜透性，使电解质渗透率提高[15，16]。有研究表明，随低温持续时间的延长，电解质渗透率呈“S”形变化[17]。SOD、POD和CAT是植物抗氧化系统中清除活性氧的主要酶，在遭受逆境胁迫后，植物体首先启动SOD，将O·-2转化为H2O2和O2，POD和CAT则进一步将H2O2分解为H2O和O2，从而减轻活性氧对膜系统的伤害[18-21]。丙二醛（MDA）是细胞膜脂过氧化的产物，随着胁迫温度的降低其含量会不同程度地上升，是评价植物抗寒性强弱的参考指标之一[22-24]。本研究结果表明，与20℃对照相比，2℃和0℃低温处理能提高绿萼凤仙花叶片中的SOD和CAT活性，温度越低提高越快，说明受到低温胁迫后，绿萼凤仙花快速启动活性氧清除系统，以保护膜系统免受活性氧的伤害，此时MDA积累量较低，细胞伤害率（CIR）上升缓慢;但随着胁迫时间的延长，SOD、POD和CAT活性均降低，且温度越低其活性越低，MDA含量显著提高，CIR急剧上升，说明长时间的低温胁迫打破了植物体内的活性氧“产生—清除”平衡，造成大量的活性氧积累，对膜系统造成严重伤害。这与在金花茶[25]、南天竹[26]、冰草属植物[27]、大叶铁线莲[28]等中的研究结果基本一致。

叶绿素含量的高低可反映植物光合能力的强弱[29]。低温胁迫会抑制叶绿素合成相关酶的活性，从而使植物体内叶绿素含量降低，影响其光合作用[30]。本试验结果也表明，2℃和0℃低温胁迫显著降低绿萼凤仙花叶片中的叶绿素含量，且随胁迫时间的延长呈下降趋势，可能是因为绿萼凤仙花对低温的应激反應使体内叶绿素合成相关酶活性快速降低，导致叶绿素含量急剧下降，而长时间低温胁迫使伤害进一步加剧，导致叶绿素含量继续降低。

脯氨酸（PRO）、可溶性糖（SS）和可溶性蛋白（SP）是细胞内重要的渗透调节物质。SP在植物体内起着维持渗透调节及防止原生质体脱水的作用[31，32]，低温冷害会引起细胞蛋白质的一系列变化，主要表现在SP含量增加，是植物产生抗寒性的重要过程[33];而冷驯化下，植物的抗寒性可因SS和PRO的累积而提高[34-36]。本研究结果表明，2℃和0℃低温胁迫能提高绿萼凤仙花叶片中的PRO、SP和SS含量。其中，2℃胁迫期间的PRO含量均高于对照，24h后差异显著，而0℃胁迫24h内的PRO含量显著高于对照，之后与对照差异不显著;两低温处理的PRO含量分别于胁迫12、48h达到峰值，温度越低，达到峰值的时间越短，PRO含量下降越快。这与李庆华等[34]对不同基因型日本柳杉的抗寒性研究结果相似。SS含量在两种低温胁迫期间波动变化，但均在胁迫72h时显著高于对照，总体呈现温度越低，SS积累越快，含量越高，这可能是因为低温胁迫会影响淀粉及蛋白质分解酶的活性，进而影响细胞内的SS含量[37]。SP含量随低温胁迫时间的延长而增加，均在胁迫72h时最高，且温度越低，SP积累越快，含量越高，可能是因为低温胁迫使部分抗寒蛋白质合成增加，从而提高植株内的渗透调节作用以减轻低温对其的伤害。

对不同温度下绿萼凤仙花各生理指标间的相关性进行分析，发现CIR与胁迫时间始终呈极显著正相关，且相关性随温度的降低而升高。进一步分析CIR与其他指标的相关性，发现MDA、SP和叶绿素含量及POD活性在绿萼凤仙花受低温胁迫的不同阶段对细胞损伤响应明显。

4结论

2℃和0℃低温处理72h能对绿萼凤仙花造成一定伤害，且温度越低、胁迫时间越长，伤害越重，0℃胁迫下生长受抑并表现出一定的寒害特征，因此，绿萼凤仙花引种时应做好防寒保护措施，预防低于0℃的极端温度伤害。CIR、叶绿素含量、MDA含量、SP含量和POD活性可作为绿萼凤仙花耐寒性鉴定的主要指标，SOD和CAT活性、PRO和SS含量可作为次要指标。本研究结果可为绿萼凤仙花的引种驯化、花期调控、抗寒育种等提供参考。