李海峰，刘志刚，任红松，刘河疆

（1.新疆农业科学院 吐鲁番农业科学研究所，新疆 吐鲁番 838000；2.新疆农业科学院 农业质量标准与检测技术研究所，新疆 乌鲁木齐 830091）

邻苯二甲酸酯（Phthalic Acid Esters， PAEs），又名酞酸酯，俗称塑化剂，是一种人工合成的具有环境毒性的有机化合物，其作为增塑剂在塑料薄膜、儿童玩具、包装袋等行业中被广泛应用，在塑料中的含量高达40%~60%［1-3］。PAEs以非共价键的形式与塑料结合，彼此保持相互独立的化学性质；塑料中的PAEs化合物很容易迁移释放到外界环境中，造成土壤、水、大气的污染［4-5］。邻苯二甲酸酯具有致突变、致癌和致畸性，难以自然降解，能长久地保留于环境中，不仅能影响植物的生长及生理生化特征，而且在植物中具有一定的生物累积效应，能通过食物链最终富集在人体中，危及人体的健康安全［6-9］。近年来，国内许多学者对我国设施农业土壤中的PAEs化合物进行了调查，各地土壤均出现了不同程度的PAEs污染，局部地区设施土壤中DBP浓度已超过美国环保署（EPA）土壤环境控制标准，在相应农产品中也有不同程度的检出，其中DEHP、DBP、DIBP的浓度和检出率较高，其健康风险不容忽视［10-12］。在设施葡萄的生产中，地膜和棚膜应用广泛，由于设施大棚棚内温度高、湿度大，棚膜及地膜中的PAEs化合物很可能在大棚土壤和空气内聚集，从而影响葡萄植株的正常生长及其产品的质量安全。因此，研究葡萄植株对土壤中邻苯二甲酸酯的吸收累积规律，对设施葡萄安全生产具有重要意义。植物根系可以从土壤溶液中吸收PAEs，在蒸腾流的驱动下，沿木质部向上转运至茎叶［13-14］。研究发现：花椰菜和辣椒植株中的邻苯二甲酸酯污染主要来源于根部对土壤中邻苯二甲酸酯的吸收；萝卜茎叶可以吸收污染土壤中挥发出来的DBP和DEHP，但直根吸收转移是萝卜茎叶中DBP和DEHP的主要来源［15-16］。不同种类植物对邻苯二甲酸酯的吸收能力和累积程度不同，植物根系吸收累积PAEs的行为不仅与其理化性质有关，也受植物根系内部脂肪、碳水化合物、蛋白质等组成物质的影响。关于葡萄植株吸收累积PAEs的相关研究鲜有报道。笔者采用盆栽覆盖玻璃罩的方式，研究了葡萄植株各器官及其内部主要物质对邻苯二甲酸正二丁酯（DBP）、邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）、邻苯二甲酸二异丁酯（DIBP）的吸收累积特征，揭示了这3种化合物在葡萄植株的累积规律，以期为设施葡萄的安全生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验土壤为棕漠土，是当地主要土壤类型。其理化性状为： pH值7.72，有机质含量11.5 g/kg，碱解氮含量224.5 mg/kg，有效磷含量21.2 mg/kg，速效钾含量178.0 mg/kg。

供试葡萄苗为3年生无核白葡萄，为吐鲁番地区主栽品种。

供试邻苯二甲酸酯污染物有邻苯二甲酸正二丁酯（DBP）、邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）、邻苯二甲酸二异丁酯（DIBP）。

1.2 试验设计

据报道，当土壤中的DBP及DIBP含量超过20 mg/kg 时，会对辣椒的生长产生显著的抑制作用；当土壤中DBP和DEHP复合污染物的浓度达到100 mg/kg时，会导致上海青叶片失绿发黄，甚至整株死亡［17-18］。据此，本盆栽试验土壤中PAEs污染物的添加量设置了空白（0 mg/kg）、低污染水平（10 mg/kg）、高污染水平（50 mg/kg），分别记为CK、T1和T2处理，每个处理重复4次。为了减少大气中PAEs污染物对试验的干扰，每盆均加盖玻璃罩，在玻璃罩两侧设置通风口，以保证葡萄的正常生长。

1.3 盆栽试验

原土壤：采取大田10~30 cm土壤，除去根和石块，在避光下自然风干，研磨过5 mm的筛，作为试验原土壤。

污染土壤制备：分别取DBP、DEHP、DIBP各50 μL（PAEs质量约为50 mg），用100 mL甲醇溶解混合；然后将PAEs的甲醇溶液添加到500 g过2 mm筛的原土壤中，不断搅拌，使PAEs在土壤中分布均匀；最后将0.5 kg混匀的污染土与4.5 kg原土壤充分混合，得到目标浓度均为10 mg/kg的污染土壤。浓度为50 mg/kg的污染土壤按照上述方法制备。供试土壤中PAEs的初始含量见表1。

表1 供试土壤中PAEs的初始浓度 mg/kg

盆栽试验于2019年4月至9月在新疆农业科学院吐鲁番农业科学研究所实验基地进行。试验花盆材质为陶瓷，直径40 cm，高32 cm。在试验期间各处理葡萄的水、肥管理一致。在葡萄成熟期，将葡萄植株连根取出，带回实验室，将葡萄的根、茎、果实用水冲洗干净，于55 ℃烘干粉碎，待测。

1.4 分析方法

1.4.1 样品处理 样品前处理和净化方法参照文献［19］。称取10.00 g土壤样品于三角瓶中，加入水10 mL、乙腈40 mL，在摇床上以200 r/min的速率振荡2 h；再将其倒入100 mL玻璃离心管中，在4 ℃下以3500 r/min离心5 min。离心后用滤纸将上层液体过滤到装有5~6 g氯化钠的具塞量筒内，用力振荡后静置30 min；分层后取上层有机相20 mL，移入150 mL圆底烧瓶内，旋转蒸发至近干，再加入正己烷3 mL。称取20 g植物样品，放入烧杯中，加入40 mL乙腈，高速匀浆2 min。用滤纸过滤到已加入5~6 g氯化钠的具塞量筒内，剧烈振荡1 min，静置15 min，然后取10 mL到150 mL圆底烧瓶内，旋转蒸发至近干，再加入正己烷3 mL。上述样品使用玻璃弗罗里硅土柱净化，用丙酮-正己烷（10∶90）混合溶液淋洗液，将收集的洗脱液氮吹蒸发近干，再用正己烷定容至5 mL，混匀后移入2 mL自动进样瓶，待测。

根系糖类物质中PAEs的提取：称取根系干粉0.1~0.5 g，加水约3 mL，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约12 mL的蒸馏水冲洗研钵2~3次，将洗出液也转入三角烧瓶中。再向三角烧瓶中加入6 mol/L盐酸10 mL，搅拌均匀后在沸水浴中水解0.5 h，冷却后用10%NaOH溶液中和pH值呈中性。然后用蒸馏水定容至100 mL，过滤，得总糖提取溶液。将总糖提取溶液转移到250 mL三角瓶中，水浴蒸干，加入5 mL正己烷，提取PAEs。

根系蛋白质中PAEs的提取：根系蛋白质使用植物总蛋白提取试剂盒进行提取，将蛋白提取液水浴蒸干后加入5 mL正己烷，提取PAEs。

1.4.2 仪器工作条件

1.4.2 .1 气相条件 采用HP-5MS色谱柱（30 m× 0.25 mm×0.25 μm）；载气为氦气，流量为1.2 mL/min；进样口温度为250 ℃。脉冲不分流，传输线温度为300 ℃，进样量为2 μL。升温程序：初始温度为80 ℃，保持2 min；以20 ℃/min的速率升到160 ℃，保持5 min；再以10 ℃/min的速率升到280 ℃，保持4 min。

1.4.2 .2 质谱条件 采用电子轰击离子源，传输线温度为280 ℃，离子源温度为230 ℃，串联四级杆一150 ℃，四级杆二150 ℃；碰撞室氦气为2.25 mL/min，氮气为1.50 mL/min。采用多反应监测方式进行数据采集。3种邻苯二甲酸酯的保留时间、定性和定量离子对、碰撞电压见表2。

表2 3种邻苯二甲酸酯的保留时间、定性和定量离子对、碰撞电压

1.4.3 样品的回收率及精密度 采用低、中、高3个浓度进行加标回收率的测定，样品的回收率均在81.5%~117.6%之间。DIBP、DBP、DEHP的检出限分别为0.106、0.215、0.489 μg/kg；定量限分别为0.353、0.716、0.163 μg/kg；相对标准偏差分别为6.7%、5.6%、8.9%。

1.5 生物富集系数

生物富集系数（Bioconcentration Factor， BCF）是用来评价污染物在土壤－植物体系中迁移的难易程度，也是植物吸收累积污染物能力的评价指标之一。本试验利用生物富集系数（生物富集系数＝葡萄各部位PAEs含量/土壤中PAEs含量）衡量邻苯二甲酸酯从土壤迁移到葡萄植株体的难易程度。

1.6 数据分析

采用Microsoft Excel 2007和SPSS 19.0软件对试验数据进行统计分析；单因素相关显著性检验采用LSD（least significant difference）法，置信水平为95%。

2 结果与分析

2.1 葡萄植株不同部位PAEs的含量及分布

表3、表4分别列出了葡萄植株不同部位DBP、DEHP和DIBP的含量及其组成比例。由表3可以看出，随着土壤中PAEs污染浓度的增高，葡萄植株各部位对DBP、DEHP和DIBP的累积量逐渐增大，在不同污染水平下3种化合物的含量存在显著差异（P<0.05）。在3种化合物中，DEHP在葡萄植株中的含量最高，其次为DBP，而DIBP的累积量最小；就高污染处理而言，葡萄植株中DEHP的含量分别是DBP和DIBP的7.9、11.5倍。在相同污染水平下，葡萄植株各部位DBP、DEHP和DIBP的含量表现为根>茎>果实，其中根系中三者的含量显著高于茎和果实。由表4葡萄植株不同部位PAEs累积量占累积总量的百分比可知，在污染处理中，DBP、DEHP和DIBP的含量在根中占84.91%~99.48%，在茎中占0.34%~8.70%，在果实中占0.18%~8.87%，其中DEHP在根中的占比高达99.48%，DBP和DIBP在根中的占比也在84%以上，可见，这3种化合物主要累积在葡萄根系中。

表3 葡萄植株不同部位PAEs的含量 μg/kg

表4 葡萄植株不同部位PAEs累积量占累积总量的百分比%

2.2 葡萄植株各器官对PAEs的生物富集能力

表5为葡萄植株各器官对PAEs的富集系数。由表5可知，葡萄根系对DBP、DEHP和DIBP的富集系数介于0.012~0.163，茎和果实的富集系数在0~0.002之间，根对三者的富集系数远大于茎、果实，说明根系对DBP、DEHP和DIBP的富集能力强于茎和果实。在各化合物中，根系对DEHP的富集系数最大，为0.163；其次为DBP；对DIBP的富集系数最小，为0.012。

表5 葡萄植株各器官对PAEs的富集系数

2.3 葡萄根系中蛋白质及其PAEs的含量

由图1可知，葡萄根系总蛋白含量随土壤污染水平升高而递减，高污染处理的根系总蛋白含量与CK差异显著（P<0.05），表明高浓度的PAEs对葡萄根系蛋白质的合成具有显著的抑制作用。通过对葡萄根系蛋白质中的PAEs进行测定，蛋白质中均检出DBP、DEHP和DIBP这3种化合物（图2）。3种化合物在蛋白质中的含量随着土壤污染水平的升高而显著增大（P<0.05）。在高污染水平（T2）下，蛋白质中DIBP含量高达558.95 μg/kg，分别是DEHP和DBP含量的1.7倍和5.3倍。将不同处理的根系蛋白含量与其PAEs含量进行分析，蛋白质中PAEs含量与蛋白含量没有相关性，与土壤污染水平显著相关。

2.4 葡萄根系总糖及其PAEs的含量

图3、图4分别显示了葡萄根系总糖及其PAEs的含量。由图3可知，污染处理（T1、T2） 葡萄根系的总糖含量均小于CK，且与CK差异显著（P<0.05），说明土壤中PAEs污染物对葡萄根系糖的累积具有抑制作用。对糖类物质中的DBP、DEHP和DIBP进行检测，3种化合物均被检出，其含量随土壤污染水平升高而增加，高污染水平与低污染水平、CK差异显著（P<0.05）。各处理根系糖类中3种化合物的含量表现为DEHP>DBP>DIBP，在高污染水平中，DEHP含量高达2135.3 μg/kg，分别是DBP和DIBP含量的3.2倍和16.1倍。对各处理的总糖含量与其PAEs含量进行分析，发现糖类中PAEs含量与糖含量没有相关性，与土壤污染水平显著相关。

图1 PAEs对葡萄根系蛋白含量的影响

图2 葡萄根系蛋白质中PAEs的含量

图3 PAEs对葡萄根系总糖含量的影响

3 讨论

邻苯二甲酸酯作为农业土壤中普遍存在的一类有机污染物，能在土壤-植物系统间迁移、转运、分配，最终被植物吸收。植物体内PAEs的成分、含量与土壤有显著相关性。有研究发现，花生［20］、西红柿［21］、水稻［22］等农作物中邻苯二甲酸酯的浓度与土壤污染程度呈显著正相关。本研究通过盆栽试验对不同污染水平下葡萄植株吸收累积DBP、DEHP和DIBP的特征进行了分析，发现葡萄植株中3种化合物的含量随着土壤污染程度的增加而显著升高，表明葡萄植株中PAEs污染物来源于土壤，与上述研究结果一致。在同一污染水平下，葡萄植株各部位PAEs及各单体的含量存在显著差异，根部含量最高，占比达84.91%~99.48%，表明DBP、DEHP和DIBP这3种化合物主要累积在葡萄根系中。周震峰等［15］研究发现，邻苯二甲酸酯在花椰菜和辣椒根中的含量显著高于叶、茎和果实，而在冬瓜中的含量表现为茎叶>根>果实。张晓蕾等［23］也证实，冬瓜茎中DEHP的含量是根的11倍，说明不同植物对邻苯二甲酸酯的吸收累积途径可能存在差异。

图4 葡萄根系糖中PAEs的含量

在本试验结束后对污染处理土壤中PAEs的残留量进行了测定，发现各处理土壤中DBP、DEHP和DIBP的含量均出现了不同程度的下降，与初始含量相比，低污染处理3种化合物的含量分别下降了11.2%、29.5%、7.3%，高污染处理分别下降了8.9%、21.2%、5.7%，三者在葡萄植株中的富集量远小于在土壤中的下降量，说明土壤中PAEs可能通过其他途径降解或代谢。相关研究也表明，土壤中的DBP、DEHP能被植物吸收富集，并且在体内代谢出毒性比母体更高的单酯产物［24］。本试验未在培养期间对土壤及植株中DBP、DEHP和DIBP的残留及其代谢物的累积变化进行监测，3种化合物在土壤和葡萄植株中的代谢情况不明确，有待进一步深入研究。

富集系数可以反映植物对邻苯二甲酸酯吸收、累积的能力。作物种类不同，其对邻苯二甲酸酯的吸收富集能力有很大的差异。有学者研究了不同种类蔬菜对邻苯二甲酸酯的富集能力，结果发现根菜类>花菜类>果菜类>茎菜类>叶菜类［25］。吴山等对不同蔬菜可食部位对PAEs富集能力的研究显示，萝卜、黄瓜和芥蓝的富集系数较高，富集系数均大于6，而白菜、生菜等叶菜类的富集系数为1~3，两者表现出较大的差异［26］。本研究对葡萄植株不同部位邻苯二甲酸酯的富集系数进行了分析，发现葡萄根系对DBP、DEHP和DIBP的富集系数在0.012~0.163，茎和果实的富集系数在0~0.002，富集系数均小于1，说明葡萄对PAEs的富集能力较弱。邻苯二甲酸酯在植物叶片、茎、果实、根系等器官中的富集量也因植物种类不同而异。研究表明，在相同的土壤中，大豆、玉米主要在根部累积DBP、DEHP，而小麦对DBP、DEHP的累积主要集中在籽粒中［27］。肖凯恩等研究发现，萝卜、茄子、黄瓜等蔬菜吸收的邻苯二甲酸酯主要累积在表皮，只有少量的PAEs会累积于肉质部［28］。在本研究中，邻苯二甲酸酯主要富集在葡萄根系中，地上部分富集很少，说明根系的富集能力较强。

邻苯二甲酸酯的理化性质，如分子量、辛醇-水分配系数也影响其在植物中的富集。DIBP、DBP的分子量和Kow较小，比较容易被植物吸收、运移，而DEHP的分子量和Kow较大，不容易被植物吸收并向地上部运移，容易滞留在根部［29］。本研究发现，葡萄根系对DEHP的富集系数最大，为0.163，显著高于DBP和DIBP的富集系数，说明根系对DEHP的富集能力强于对DBP和DIBP的，在植株中不易迁移、吸收，容易滞留在根部，这符合上述理论。

本研究进一步对葡萄根系蛋白和总糖含量及两者中PAEs含量进行了测定，发现在不同浓度PAEs处理下，葡萄根系总蛋白和总糖含量均低于对照，且高污染水平下的两者含量最低，与对照差异显著。Sharma R等研究发现，巨型浮萍在高浓度的DEP胁迫下，其蛋白含量较对照降低了76%［30］。杨子江等通过室内盆栽模拟试验发现，在成熟期，水稻叶片中可溶性糖含量随PAEs浓度增加而逐渐下降［8］，说明高浓度PAEs对植物蛋白和糖的合成具有抑制作用。本研究从葡萄根系蛋白质和糖类物质中均检出了目标污染物DBP、DEHP和DIBP，其含量随着土壤污染水平的升高而增大；在高污染水平下，蛋白质中DIBP含量分别是DEHP和DBP含量的1.7倍和5.3倍，糖类物质中DEHP含量分别是DBP和DIBP含量的3.2倍和16.1倍。吴遵义等［31］对冬瓜植株吸收累积DEHP机制的研究发现，冬瓜果肉中核蛋白对DEHP的累积较多，根系线粒体和叶绿体对DEHP表现出很强的累积效果，主要可能是因为线粒体和叶绿体都是由主要成分为蛋白质、脂类和糖类的磷脂双分子层包裹。可见，在植株中PAEs的累积可能与蛋白质、糖类等物质有关。目前，关于糖类物质和蛋白质对PAEs的结合能力的研究较少，有待进一步研究。

4 结论

葡萄植株中的DBP、DEHP和DIBP主要来源于土壤，各部位的累积量随土壤污染水平提高而增大。在3种化合物中，DEHP在葡萄植株中的含量显著高于DBP和DIBP的，且三者主要分布在葡萄根系中，根系对DBP、DEHP和DIBP的富集能力强于茎和果实。高浓度的PAEs对葡萄根系蛋白和糖的合成具有抑制作用。