姚晓云，杨 平，黄永萍，彭志勤，刘 进，吴延寿，邹国兴，尹建华

（江西省农业科学院 水稻研究所/水稻国家工程研究中心（南昌）/国家水稻改良中心 南昌分中心/中菲水稻技术联合实验室，江西 南昌 330200）

叶绿素是植物吸收、传递、转换光能的关键色素，叶绿素含量与功能对作物产量和品质的形成具有重要影响［1-3］。近年来，诸多研究表明叶绿素含量及其动态变化规律对水稻的产量和品质形成存在明显的影响及调控作用［4-5］。Jiang等［6］研究表明，较低的叶绿素含量导致光合作用减弱，结实率降低，籽粒充实度下降，进而显著影响稻谷产量；水稻品种叶绿素含量（SPAD值）随生育进程的推进呈现逐渐降低的趋势，分蘖期叶绿素含量与产量呈显著正相关关系。王志东等［7］研究表明，籼稻黄熟期和蜡熟期剑叶SPAD值与稻米食味值、蛋白质含量存在明显的相关性，其中黄熟期SPAD值对品质的影响更为显著，剑叶SPAD值越高，稻米蛋白质含量越低，食味品质越好。成熟期叶绿素含量降低称为叶绿素降解或衰老，一般发生在植株自然发育末期；叶绿素降解发生的时期对于植株最终产量和品质具有重要影响［8］。

水稻叶绿素含量是典型的数量性状，受多个QTL调控且存在明显的环境效应［9-10］。近年来，有关水稻叶绿素含量的研究较多，已有650个相关的QTL被鉴定报道，但仅有 qLSCHL4、qFCC7L、qSPAD4和qCTH4等少数几个主效QTL被精细定位或克隆，已定位的位点主要为孕穗~抽穗期叶绿素QTL；而有关不同生育时期叶绿素含量动态变化及降解指数QTL定位的研究相对较少［11-13］。鉴于此，本研究以屉锦和北陆129杂交-回交衍生的BIL和CSSL群体为试验材料，对不同生育时期叶片叶绿素含量和降解指数进行了QTL剖析，旨在发掘与叶绿素含量和降解指数相关的主效QTL，解析不同生育时期叶绿素含量的变化规律，为水稻叶绿素含量“阶段性”分子遗传调控研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与田间试验

以屉锦和北陆129杂交-回交衍生的BIL和CSSL群体为试验材料，遗传群体均由日本农业生物资源研究所Yano博士研究团队提供。试验于2021年在江西省农业科学院水稻研究所南昌试验基地进行，于5月18日播种，湿润水育苗；在6月15日移栽，行株距为20 cm×16.5 cm，每穴1苗；其他田间管理与当地生产田相同。

1.2 性状测定

在分蘖期、抽穗期和灌浆成熟期选取中间行区的5个单株，利用叶绿素仪（SPAD-502 plus） 测定BIL和CSSL群体各株系的SPAD值，每株系选取5个单株主茎顶部叶片（剑叶），分别测定叶片上、中和下3个区域的SPAD值，共获取15个数值，利用SPAD指标评价各株系叶绿素含量，2次生物学重复，取均值统计分析。

1.3 遗传图谱构建与QTL分析

BIL群体自2009年引入，经多年田间种植后部分株系存在分离和变异，且原遗传图谱采用RFLP标记构建，遗传距离、标记密度与新的SSR和Indel标记存在明显差异。本研究利用新合成的SSR和Indel标记重新构建分子遗传图谱；新遗传图谱包括205个分子标记，覆盖基因组1561.2 cM，标记间的平均距离为7.58 cM，染色体平均标记数为17.08个；CSSL群体的遗传图谱参考Ando等［14］公布的数据。

采用CTAB法提取水稻基因组DNA，PCR扩增体积为10 μL，包括DNA模板1.5 μL、引物（10 μmol/L）各1.25 μL、5.0 μL的2×Es Taq Master PCR混合体系、1.0 μL ddH2O。PCR扩增程序为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 35 s，55~58 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，32个循环；72 ℃ 7 min，10 ℃保存备用。PCR扩增产物采用4%~5%的琼脂糖凝胶电泳检测。采用QTL ICI Mapping v4.2软件的完备区间作图（ICIM）方法［15］进行QTL检测分析，LOD阈值设为2.50，当标记区域LOD值≥2.50时，就判定该区段存在1个QTL，同时估算每个QTL的加性效应值和贡献率大小。QTL的命名遵循McCouch等［16］的原则。利用CSSL群体进行QTL验证分析，发掘和验证调控叶绿素含量的主效QTL，并将染色体片段代换系与受体亲本进行比较和差异显著性分析，鉴定相关主效QTL。

2 结果与分析

2.1 表型分析

亲本在抽穗期和不同生育时期的叶绿素含量存在显著差异，呈现动态变化特征；高产籼稻北陆129在不同生育时期的叶绿素含量明显高于优质粳稻屉锦，且其降解指数较小，具有较好的持绿特性。BIL群体各株系的抽穗期、叶绿素含量和降解指数存在较大变幅，存在超亲分布现象，峰度和偏度值接近于1.00，表现为正态连续分布，这表明抽穗期、叶绿素含量和降解指数属于多基因控制的数量性状，符合QTL作图要求（表1、图1）。

相关分析表明：抽穗期仅与降解指数存在极显著相关性，与各生育时期叶绿素含量未达到显著相关性；抽穗期叶绿素含量与分蘖期、成熟期叶绿素含量存在极显著相关；分蘖期叶绿素含量与成熟期叶绿素含量未达到显著相关性；叶绿素降解指数与抽穗期和成熟期叶绿素含量的相关性达到极显著水平，与分蘖期叶绿素含量的相关性不显著（表2）。

2.2 QTL分析

BIL群体共检测到17个与叶绿素含量相关的QTL，分布于第1~5、7、9和11号染色体上（表3、图2），单一QTL解释13.99%~27.04%的表型变异。检测到4个调控抽穗期的QTL，分别位于第1、7、11和12号染色体上，其中qHD7和qHD12的贡献率和加性效应值较大，是2个主效调控抽穗期的位点；在分蘖期检测到4个与叶绿素含量相关的QTL（qCHT2、qCHT4、qCT9和qCT12），其中qCHT2的LOD值和贡献率最大，分别为13.25%和25.79%；qCHT4和qCHT9的加性效应值较大，分别为2.66和-2.72，前者增效等位基因来自北陆129；检测到影响抽穗期叶绿素含量的QTL 4个，分别位于第2、4、5和9号染色体上，其中qCHH2和qCHH5的贡献率和效应值较大；在成熟期检测到5个与叶绿素含量相关的QTL，分别为qCHM1、qCHM3、qCHM4、qCHM5和qCHM12，其中qCHM3和qCHM4的贡献率和效应值较大，且有益增效等位基因均来自北陆129；检测到3个与叶绿素降解相关的QTL（qCD3、qCD4和qCD9），其 中qCD4的 贡 献 率和效应值较大，可以延缓叶绿素降解（图2）。

表1 亲本和BIL群体在不同生育时期叶绿素含量的表型分析

图1 亲本和BIL群体在不同生育时期叶绿素含量的表型分析

表2 不同生育时期叶绿素含量相关分析

图2 水稻不同生育时期叶绿素含量QTL染色体分布

2.3 CSSL验证分析

以受体亲本屉锦为对照，将染色体片段代换系的抽穗期叶绿素含量、成熟期叶绿素含量和降解指数逐一与对照进行差异分析，结合染色体片段局部代换分析鉴定相关QTL。研究共发现叶绿素含量和降解指数存在显著差异的株系8个，包括SL02、SL09、SL14、SL25、SL28、SL32、SL33和SL39（图3），鉴定出7个与叶绿素含量相关的QTL簇，分别为qSPAD1、qSPAD3、qSPAD4、qSPAD7、qSPAD9、qSPAD10和qSPAD12（表4）。有4个QTL簇与BIL群体存在共表达，即qSPAD1与qCHM1，qSPAD3与qCHM3、qCD3，qSPAD4与qCHH4、qCHM4，qSPAD9与qCHT9、qCHH9所在染色体区域相近；与以往研究比较发现，这些位点具有较好的重演性。同时，我们还发现了一个新的主效QTL qSPAD12。

3 讨论与结论

叶绿素是水稻植株进行光合作用的物质载体，改良植株的光合性能、提高叶绿素含量是增强光合速率和提高水稻产量潜力的关键所在［17-19］。水稻全生育期叶绿素合成与降解是一个动态过程，不同生育时期叶绿素含量存在动态变化，这种动态变化对穗部产量和品质性状具有显著影响，尤以抽穗~成熟期影响效应最为显著。在生育前期叶绿素为营养器官形成提供物质基础；在孕穗~抽穗期叶绿素为巩固枝梗、积累灌浆储备物质和提高结实率奠定基础；在灌浆成熟期叶绿素为籽粒结实、灌浆和粒重形成提供关键物质来源［9，20-21］。本研究表明，不同生育时期叶绿素含量存在明显的动态变化，各时期叶绿素含量存在一定相关性，抽穗期叶绿素含量与分蘖期、灌浆期叶绿素含量及降解指数存在极显著相关性。研究还发现，分蘖期亲本和BIL群体的叶绿素含量较高，植株叶绿素代谢以合成为主；抽穗后叶绿素含量逐渐降低；灌浆成熟期多数株系的叶绿素含量显著降低，叶绿素代谢以降解反应为主。此外，研究也表明，抽穗时期早晚对叶绿素含量和降解指数有明显影响，抽穗期与降解指数呈现极显著正相关。这表明，水稻生长发育进程中叶绿素含量依据源供给和库需求表现出明显的动态变化，植株生产潜力受叶绿素含量、动态变化和生育期等多因素的共同影响，选育叶绿素含量适宜和源库流协调的水稻新品种是实现高产优质的途径之一。

表3 不同生育时期叶绿素含量相关QTL分析

表4 利用CSSL群体鉴定叶绿素含量相关QTL

调控不同生育时期叶绿素含量的QTL不尽相同，控制不同发育阶段叶绿素含量的遗传基础存在明显差异，叶绿素代谢基因存在时空表达现象［11，22-23］。阿加拉铁等［20］对灌浆结实期不同阶段叶绿素含量进行QTL分析，共检测到7个与叶绿素相关的QTL，调控叶绿素含量的QTL存在时空表达特性，多数QTL仅参与调控某一阶段的叶绿素含量，少数几个QTL在整个时期持续表达；李永洪等［24］利用RIL群体对分蘖期和抽穗期叶绿素含量进行QTL定位，在两年环境下共检测到30个QTL，单个QTL的表型贡献率为5.91%~38.69%，其中8个位点在不同年份环境下共性表达。本研究利用BIL群体对不同生育时期叶绿素含量进行QTL分析，共检测到13个与叶绿素含量相关的QTL，这些QTL大致可分为3类：第一类为调控某一时期叶绿素含量的QTL，包括qCHM1、qCHM3和qCHM4；第二类为调控多个生育时期叶绿素含量的QTL，包 括qCHL2（qCHT2、qCHH2）、qCHL4（qCHT4、qCHH4）、qCHL5（qCHH5、qCHM5）和qCHL9（qCHT9和qCHH9）；第三类为调控叶绿素降解的QTL，包括qCD3、qCD4和qCD9，其中降解指数QTL qCD3与qCHM3、qCD4与qCHM4位于相同染色体区域，这表明叶绿素降解与定位区域内QTL阶段性表达有关。

利用CSSL群体初步鉴定了7个影响叶绿素含量的染色体区段，其中qSPAD1、qSPAD3、qSPAD4和qSPAD12分别与BIL群体检测到的主效QTL簇qCHL1、qCHL3、qCHL4和qCHL12所在染色体区域相近，这些位点在不同群体中共性表达，且表型贡献率较大，可能是决定叶绿素含量的关键QTL。与前人定位结果标记进行对比分析，发现qSPAD1与GN1a区域相近，可能是GN1a基因的多效性；qCHL3与姜树坤等［11］鉴定的叶绿素代谢关键区域qCHH3相近；qCHL4所在区域为调控水稻叶绿素含量的热点区域，该区域已有qSPAD4［25］、qCTH4和qNAL1［26］等主效QTL被精细定位，这些产量相关基因在水稻品种改良中被有意识利用，优异单倍型在育成品种中广泛存在。qCHL12/qSPAD12是本研究新发现的一个调控叶绿素含量的主效QTL，该QTL区域具有影响抽穗期和调控不同生育期叶绿素含量的功能，且其LOD值、表型贡献率和效应值均较大，其相关染色体区域的功能和调控机理仍需进一步研究确定。