曾韦珊 黄林旺 陈曼钰 毛积鹏,2黄少伟 宁华珙 刘天颐

(1. 华南农业大学 林学与风景园林学院/ 广东省森林植物种质创新与利用重点实验室，广东 广州 510642;2. 台山市红岭种子园，广东 台山 529223; 3. 英德市林业科学研究所，广东 英德 513055)

由于松属植物中含有丰富的化学物质，常作药用植物，据《本草纲目》记载：“松叶，名为松毛，性温苦，无毒，入肝、肾、肺、脾诸经，治各脏肿毒，风寒湿症。还能治疗肿疱，促进毛发再生，强健肝、肾、心、脾、肺五脏，能够充饥，延年益寿”[1]。据分析，松属植物松针中含有萜类、黄酮类、木质素类、挥发油类、氨基酸类等化学物质，如南方马尾松Pinus massoniana松针中含有单萜和倍半萜[2]，王巍等[3]从马尾松松针中分离出木犀草素、槲皮素、双氢槲皮素等黄酮类化合物，周维纯等[4]从马尾松针叶中测定出18种氨基酸，从黑松P. thunbergii针叶中亦测定出18种氨基酸，高岩等[5]从红松P. koraiensis松针中分离出7 个黄酮苷类化合物，松针活性成分逐步被明晰，这也使其在医药保健应用中广受关注[6]。

火炬松P. taeda为松科松属乔木，原产北美东南部，是美国南方松中最重要的速生针叶树种之一[7-8]。我国引种火炬松已有70 多年的历史，但对火炬松松针和树皮中活性成分的研究尚未见有关报道。鉴于此，本研究利用UPLC-MS/MS 代谢组学技术对火炬松的主要药用部位包括针叶、树皮部位主要代谢物成分进行测定并做比较分析，旨在为火炬松代谢物成分鉴定、分布特性及其开发应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

火炬松样本材料取自于广东省英德市林业科学研究所（N 23°50′31″，E 112°45′15″）。2019 年8月随机选取9 个8 年生的火炬松无性系（28-7-43、19-11-44、7-15-14、15-4-15、44-2-6、34-1-9、44-13-5、26-Ⅲ-4、西2-1-1）取样，采取了生长旺盛、无病虫害的火炬松针叶和树皮组织部位，将任意3 个无性系的相同部位混在一块作为一份样本，每个样本3 个生物学重复，剪碎后放入50 mL无菌的离心管中，随即放入液氮中，在-80 ℃条件下保存。

1.2 样品制备

在冻干机（Scientz-100F）中真空冷冻干燥火炬松各组织部位样品，之后用研磨仪（MM 400，Retsch）研磨样品至粉末状，称取约100 mg 粉末溶解于1.2 mL 70%甲醇（色谱级， Merck）中。在4 ℃ 条件下提取12 h，每2 h 涡旋震荡1 次，以提高提取率。12 000 rpm 条件下离心10 min，然后取上清，用微孔滤膜（0.22 μm，pore size）过滤样本，随后保存于进样品中用于UPLC-MS/MS 分析。

1.3 色谱和质谱数据采集

色谱数据采集仪器：超高效液相色谱（SHIMADZU Nexera X2, https://www.shimadzu.com.cn）。采集条件：Agilent SB-C18 色谱柱（1.8 μm,2.1 mm×100 mm）；A 相超纯水（加入0.1%的甲酸），B 相乙腈（色谱级，Merck）的流动相；洗脱梯度：0.00 min，B 相比例为5%，B 相比例在9.00 min 内线性增加到95%，并维持95% 1 min，10.00—11.10 min，B 相比例降至5%，在5%条件下平衡至14 min；流速设为0.35 mL/min，柱温40 ℃，进样量4 μL。

质谱数据采集仪器：串联质谱（Applied Biosystem 4500 QTRAP, http://www.appliedbiosystem.com.cn）仪器。采集条件为：温度550 ℃电喷雾离子源（Electrospray Ionization，ESI），质 谱 电 压5 500 V（正模式）/-4 500 V（负模式），帘气（Curtain gas，CUR）25 psi，碰撞诱导电离（Collision-Activated Dissociation, CAD）参数设置为高。根据优化的簇电压（Declustering Potential，DP）和碰撞能进行三重四级杆中每个离子对的扫描检测[9]。

1.4 代谢物定性与定量分析

委托迈特维尔生物科技有限公司基于自建数据库MWDB（metware database）根据二级谱信息对物质进行定性分析，分析时将含K+离子、Na+离子NH4+离子和同位素信号重复信号去除。利用三重四级杆质谱的多反应检测模式进行代谢物定量分析。首先四级杆筛选出目标物质的前体离子，前体离子经过诱导电离后形成碎片离子，之后碎片离子通过三重四级杆过滤选择出特征碎片离子。随后进行峰面积积分，并积分校正其中同一代谢物在不同样本中的质谱出峰[10]。

1.5 数据分析

质谱数据的处理：利用MultiaQuant 软件和Analyst 1.6.3 软件打开和处理数据。随后积分并校正色谱峰，每个色谱峰的面积代表对应物质的相对含量，最后导出所有色谱峰面积积分数据保存。样本数据分析：用主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（Orthogonal Partial Least Squares—Discriminant Analysis，OPLS-DA）方法进行分析，PCA 用R软件中的Prcomp 函数对进行归一化处理后的数据进行分析，OPLS-DA 在原始数据进行log2 转换后，再进行中心化处理，利用R 软件中的MetaboAnalystR 包的OPLSR.Anal 函数进行分析。差异代谢物的筛选：通过载荷图和变量重要性投影（Variable Importance in Projection，VIP）值大于等于1 来筛选差异代谢物。

2 结果与分析

2.1 代谢物鉴定

利用UPLC—MS/MS 法可从火炬松针叶和树皮组织中共鉴定出523 种代谢物成分，其正离子模式下混合样本的质谱分析总离子流图如图1 所示，各峰分离效果良好。其中氨基酸及其衍生物40 种、酚酸类物质66 种、核苷酸及其衍生物38种、类黄酮化合物165 种、木脂素和香豆素类化合物28 种、鞣质类20 种、生物碱24 种、萜类化合物4 种、有机酸30 种，脂质55 种、其它类化合物53 种。165 种类黄酮代谢化合物中，查尔酮有4 种、二氢黄酮10 种、二氢黄酮醇6 种、花青素17 种、黄酮55 种、黄酮醇59 种、黄酮碳糖苷1 种、黄烷醇类11 种、异黄酮2 种。

图1 正离子模式下火炬松混合样本的质谱分析总离子流Fig.1 Total ions current of mass spectrometry analysis of mixed samples of P. taeda in positive ion mode

2.2 多元统计分析

为比较火炬松针叶和树皮样本之间总体代谢差异和组内样本之间的变异度大小，对火炬松针叶和树皮代谢物进行主成分（PCA）分析（图2A）。结果表明，第一主成分（PC1）的解释率达到61.95%，第二（PC2）和第三主成分（PC3）共解释了25.58%，其中PC2 的解释率为18.73%。如图2B 所示，火炬松树皮（SP）3 个样品均位于PC1 负半轴，火炬松针叶（SZ）3 个样品均位于PC1 正半轴，不同组织分离明显，说明2 种不同部位样品在代谢物成分上有明显差异。同时，同一组织部位的不同样本也相对分散，说明组内样本间也存在一定差异。

图2 火炬松针叶和树皮组织样本的多元统计分析Fig.2 Figure 2 Multivariate statistical analysis of Pinus taeda needle and bark tissue samples

另外，运用OPLS-DA 法构建S-plot（图3A）可知，火炬松针叶和树皮区分明显，且很大一部分代谢物的VIP 值大于或等于1，表明这些代谢物成分在火炬松针叶和树皮中的含量差异显著。从OPLS-DA 模型的置换验证结果发现（图3B），建立的OPLS-DA 模型共得到两个主成分，R2X=0.724，R2Y=1，Q2=0.98，这3 个 模 型 参 数 均 大 于0.5，OPLS-DA 模型拟合准确较好，具有意义，因此本研究所建立的OPLS-DA 模型能够有效解释火炬松针叶和树皮之间的代谢差异。

图3 OPLS-DA 分析Fig.3 OPLS-DA analysis

2.3 差异代谢物鉴定

差异代谢物的筛选根根据单变量分析的差异倍数（Fold change）值和多元统计分析OPLS-DA模型的VIP 值来选择，Fold change 小于等于0.5或大于等于2，且VIP 值大于等于1 的代谢物认为差异显著。鉴定到523 种代谢物中，221 种代谢物成分的含量在火炬松的针叶和树皮组织部位中没有显著差异，另外302 种代谢物成分则在火炬松的针叶和树皮组织部位中差异显著。差异显著的代谢物成分中，147 种代谢物成分在火炬松针叶组织部位中的含量高于树皮组织中的含量，其中包括70 种类黄酮化合物和7 种氨基酸及其衍生物，如表1 所示。而另外155 种代谢物成分则在火炬松树皮组织部位中的含量显著高于针叶组织，其中包含35 种类黄酮化合物和20 种氨基酸及其衍生物，如表2 所示。此外，分析发现柚皮素、山姜素、山奈酚、泽兰黄素、秦皮甲素等在火炬松针叶组织中的含量显著高于树皮组织；而槲皮素、矢车菊素、原花青素、丁香树脂酚、表儿茶素等高生物代谢活性成分则在火炬松树皮组织中的含量显著高于针叶组织。

表1 在火炬松针叶组织中含量显著高于树皮组织的70 种类黄酮化合物和7 种氨基酸及其衍生物Table 1 The content of 70 kinds of flavonoids and 7 kinds of amino acids and their derivatives in P. taeda needle tissue is significantly higher than that in bark tissue

差异倍数Fold change C16H12O7 鼠李素 黄酮醇 90-19-7 0.000 147 C16H12O6 羟基芫花素 黄酮 20243-59-8 0.000 621 C30H26O14 槲皮素-3-O-(6’’-反式对香豆酰基)-β-D-葡萄糖苷 黄酮 - 0.000 699 C23H22O13 槲皮素-3-O-(6’’-O-乙酰)-半乳糖苷 黄酮醇 - 0.000 733 C30H26O13 山奈酚-7-O-β-d-(6’’-O-(E)-对香豆酰)半乳糖苷 黄酮醇 - 0.002 431 C30H26O13 木犀草素-咖啡酰鼠李糖苷 黄酮 - 0.002 974 C30H26O13 银锻苷 黄酮醇 20316-62-5 0.003 180 C30H26O13 山柰酚-3-O-(2’’-反式对香豆酰基)-β-D-半乳糖苷 黄酮 - 0.003 208 C17H14O7 3,7-二-O-甲基槲皮素 黄酮醇 2068/2/2 0.003 963 C22H22O11 红车轴草素-7-O-吡喃葡萄糖苷 黄酮 36191-03-4 0.009 172 C17H14O8 丁香亭 黄酮醇 4423-37-4 0.009 769 C28H32O15 香叶木素-7-O-芸香糖苷 黄酮 - 0.010 681 C28H32O15 香叶木素-7-O-新橘皮糖苷 黄酮 38665-01-9 0.011 555 C21H20O11 山奈酚-7-O-葡萄糖苷 黄酮醇 16290-07-6 0.012 044 C15H12O4 乔松素 二氢黄酮 480-39-7 0.018 814 C23H24O12 柠檬素-3-鼠李糖苷 黄酮 - 0.031 201 C15H12O5 柚皮素 二氢黄酮 480-41-1 0.039 770 C23H24O12 鸢尾新苷 异黄酮 94396-09-5 0.041 780 C15H12O5 短叶松素 二氢黄酮醇 548-82-3 0.041 861 C21H20O11 山奈酚-3-O-葡萄糖苷(紫云英苷)(黄芪苷) 黄酮醇 480-10-4 0.043 946 C15H12O5 柚皮素查尔酮 查耳酮 73692-50-9 0.044 580 C15H12O5 紫铆素 二氢黄酮 492-14-8 0.050 885 C22H22O11 异鼠李素-3-O-鼠李糖苷 黄酮醇 - 0.059 920 C17H14O6 5,6-二羟基-7,4’-二甲氧基黄酮 黄酮 10176-71-3 0.066 028 C21H20O11 山奈酚-3-O-半乳糖苷(三叶豆苷) 黄酮醇 23627-87-4 0.074 476 C16H14O4 球松素 二氢黄酮 480-37-5 0.091 710 C20H18O10 胡桃苷 黄酮醇 5041-67-8 0.092 208 C22H22O12 甲基槲皮素 O-己糖苷 黄酮醇 - 0.124 060 C21H20O13 杨梅素-3-O-半乳糖苷 黄酮醇 15648-86-9 0.131 126 C28H33O16+ 牵牛花素-3-O-芸香糖苷 花青素 - 0.179 466 C21H20O12 6-羟基山奈酚-7-O-葡萄糖苷 黄酮醇 - 0.189 316 C21H20O10 芹菜素 5-O-葡萄糖苷 黄酮 28757-27-9 0.190 507 C27H31O15+ 矢车菊素 3-O-芸香糖苷 花青素 28338-59-2 0.207 924 C21H18O12 山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷 黄酮醇 - 0.238 008 C27H30O15 木犀草素-7-O-芸香糖苷 黄酮 3563-98-2 0.252 641 C21H18O12 野黄芩素-7-氧-葡萄糖醛酸苷 黄酮 27740-01-8 0.254 472 C20H18O12 杨梅素-3-O-阿拉伯糖苷 黄酮醇 132679-85-7 0.267 021 C21H18O12 4-羟基黄酮-7-O-葡萄糖苷 黄酮 - 0.269 932 C25H31O11+ 锦葵色素-3-O-葡萄糖醛酸 花青素 - 0.288 216 C21H20O12 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(异槲皮苷) 黄酮醇 482-35-9 0.320 298化学式Formula物质Compounds物质二级分类Class ⅡCAS 号CAS Number

注：差异倍数为SP/SZ 值。SP 表示树皮组织，SZ 表示针叶组织。Note: fold change value was calculated by SP/SZ. SP is bark tissue. SZ is pine needle tissue.

表2 在火炬松树皮组织中含量显著高于松针组织的35 种类黄酮化合物和20 种氨基酸及其衍生物Table 2 The content of 35 kinds of flavonoids and 20 kinds of amino acids and their derivatives in P. taeda bark tissue are significantly higher than that in pine needle tissue

注：差异倍数为SP/SZ 值。SP 表示树皮组织，SZ 表示针叶组织。Note: fold change value was calculated by SP/SZ. SP is bark tissue. SZ is pine needle tissue.

2.4 差异代谢物分析

为了对有显著差异代谢物的组织变化规律及其通路分布情况有更方便和直观的了解，我们对有显著差异的代谢物成分进行了聚类和KEGG 富集分析。由聚类分析热图可知，氨基酸及其衍生物、脂质和鞣质类化合物在树皮组织中的含量较针叶组织高，L-天冬氨酸是树皮组织中含量最高的氨基酸及其衍生物类物质，反油酸是树皮组织和针叶组织中含量最高的脂质类化合物，而圣草酚是树皮组织中含量最高的类黄酮物质。木脂素和香豆素类化合物在针叶组织中含量较高。此外，黄酮类物质和酚酸类物质在针叶和树皮组织中所占比重也较大，黄酮类化合物在针叶组织中含量高于树皮组织中的含量，其总量是树皮组织的1.74 倍。通过结合两种不同组织的分组情况及定量信息，比较检测得到的化合物差异倍数变化，其中，树皮组织中含量高于针叶组织的差异化合物共有155 个，而针叶组织中含量高于树皮组织的差异化合物共有147 个。用KEGG 数据库对检测得到的差异化合物进行通路富集分析，结果表明，含量差异显著的代谢物显著富集于类黄酮生物合成通路、黄酮与黄酮醇生物合成通路、氨酰tRNA 生物合成通路、氨基酸生物合成通路及淀粉和蔗糖代谢通路（图5）。

图4 差异代谢物聚类热图Fig.4 Different metabolites cluster heatmap

图5 差异代谢物KEGG 富集分析Fig.5 The KEGG enrichment analysis of differential metabolites

3 结论与讨论

从火炬松的针叶和树皮中共鉴定出523 种代谢物成分，主要为氨基酸类、酚酸类、有机酸类、鞣质、脂质类和黄酮类等化合物。其中，221 种代谢物成分的含量在火炬松的针叶和树皮组织部位中没有显著差异，另外302 种代谢物成分则在火炬松的针叶和树皮组织部位中差异显著。火炬松针叶和树皮组织部位之间代谢物成分含量差异显著，其中槲皮素、矢车菊素、原花青素、丁香树脂酚、表儿茶素等物质在树皮组织中的含量显著高于针叶组织，而柚皮素、山姜素、山奈酚、泽兰黄素、秦皮甲素等物质则在火炬松针叶组织中含量更高。

目前，对代谢物的分析方法主要有核磁共振技术（NMR）、气相色谱—质谱联用技术（GCMS）、液相色谱—质谱联用技术（LC-MS）、超高效液相串联质谱（UPLC-MS/MS）技术等，如户连荣等[11]用GC-MS 分析萼翅藤（Calycopteris floribunda）果实挥发油化学成分，袁兴华等[12]用GC-MS 技术对木荷Schima superba鲜花的挥发性成分进行了分析；黄浩等[13]采用GC-MS 技术分析了龙脑型阴香Cinnamomum burmannii叶片精油的主要成分。而UPLC—MS/MS 代谢组学技术由于分离速度快、灵敏度高、准确性强而被广泛运用于植物高生物活性物质的鉴定，如陈张金等[14]用UPLC-MS/MS 方法分析测定了青钱柳Cyclocarya paliurus中6 种黄酮类成分的含量；刘杰等[15]用UPLC—MS/MS 法测定白芍饮片中的10 种主要成分，宋楠楠等[16]用UHPLC -QTOF/MSE 技术对文冠果Xanthoceras sorbifolium的不同组织部位进行了代谢组学分析。本研究利用UPLC—MS/MS 代谢组学技术对火炬松的针叶和树皮组织部位的代谢物成分进行了鉴定和分析。火炬松针叶和树皮组织部位中共鉴定出代谢物成分523 种，主要包括氨基酸及其衍生物、酚酸类、核苷酸及其衍生物、鞣质、脂质和黄酮等化合物。关于松属植物化学成分的研究之前已有报道，如Feng 等[17]对云南松树皮的化学成分进行分析，从中分离鉴定出2 个新的二萜酸和8 个已知的二萜类化合物；钟胜佳等[18]从油松P. tabuliformis松针出分离鉴定出4 个黄酮苷类化合物；顾剑等[19]对樟子松P. sylvestris树皮的水提液及醇提液进行纸色谱法、试管预试法检测，从樟子松树皮中检测出多糖、黄酮、有机酸、鞣质、酚性物等成分；王莉等[20]采用试管预试法、纸色谱法对樟子松松塔提取物的不同极性部位检测，鉴定出樟子松松塔中含有氨基酸、酚性物、黄酮、香豆素、挥发油、皂苷、蒽醌、油脂等化合物。

黄酮类化合物是一种重要的次生代谢产物，在植物界中广泛存在，其在植物体内的分布是不均匀的。如王琼等[21]发现慈竹Neosinocalamus affinis叶中的总黄酮含量要显著高于枝和杆中；Wang 等[22]研究发现兴安落叶松树皮中的总黄酮含量高于针叶、枝条和茎部组织，本研究火炬松中的总黄酮含量为针叶组织高于树皮组织的结果与之相反，可能与植物种类不同有关；唐纯翼等[23]研究表明栾树Koelreuteria paniculata不同部位总黄酮含量不同，其果实中的含量明显高于枝和叶。本研究发现总黄酮在火炬松针叶和树皮组织中均有分布，但不同组织中含量有差异，可能与植物组织所承担的功能有关。黄酮类化合物异槲皮苷在火炬松针叶和树皮组织中所占含量均较高，报道显示，其在抗高血压[24]、抗氧化活性[25]、抗癌[26]、抗炎[27]等方面具有积极作用，这为火炬松在医学上的应用提供了一定信息。

本研究从火炬松针叶和树皮组织部位中鉴定出的化学成分与其他松属植物含有的化学成分类似，如黄酮类物质中有与钟胜佳等[18]从油松松针中鉴定出的异鼠李素-3-O-葡萄糖苷化合物；王巍等[3]从马尾松松针中分离纯化得到的木犀草素、槲皮素、二氢槲皮素、杨梅素类黄酮化合物，在火炬松中也鉴定出；在木脂素化合物中，火炬松中鉴定出的7S,8R-苏式-3′,4,9′-三羟基-3-甲氧基-7,8-二氢苯并呋喃-1′-丙醇基新木脂素-9-O-α-L- 吡 喃 鼠 李 糖 苷、7S,8R- 苏 式-3′,9,9′- 三羟基-3-甲氧基-7,8-二氢苯并呋喃-1′-丙醇基新木脂素-4-O-α-L- 吡喃鼠李糖苷、7S,8S- 苏式-3′,4,7,9-四羟基-3-甲氧基-8-O-4′-新木脂素-9′-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、7R,8S-赤式-3′,4,9,9′-四羟基-3-甲氧基-8-O-4′-新木脂素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷与张静娇等[28]从红松松针中分离得到的木脂素类化合物相同。用UPLC—MS/MS 法测定更快捷、准确，为火炬松代谢物成分的组织器官分布特征及其活性成分的鉴定提供了重要信息，同时为火炬松药用价值上的研究提供了参考。