张娟 李雪 蒋浩 黄晓萍

宫颈癌在全球女性常见恶性肿瘤中居第四位，在发展中国家常见恶性肿瘤中居第二位。当前的治疗策略包括手术切除、化学治疗和放射治疗，但疗效均有限。如何预防与治疗宫颈癌是全球医学工作者们共同关注的课题。竹节香附素A（RDA）是从常用的传统中草药海葵中提取的一种活跃三萜皂苷，通过抑制肿瘤细胞增殖和血管生成产生抗肿瘤活性，同时能诱导多种肿瘤细胞凋亡，如大肠癌细胞、胃癌细胞和肝癌细胞。磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B/ 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）信号通路是一条常见的细胞信号通路，由于mTOR 能调节细胞代谢活动，因此被作为抑制肿瘤细胞生长的靶点。有研究者发现，RDA 可能通过激活p38MAPK 通路和抑制mTOR 活化诱导胃癌细胞凋亡。RDA 在宫颈癌中未有相关报道。因此，本研究探究RDA 对人宫颈癌HeLa 细胞增殖和凋亡的影响，并初步探讨其可能的作用机制。

材料与方法

一、主要材料

人宫颈癌HeLa 细胞，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。RDA，纯度≥98%，购自上海源叶生物科技有限公司，批号20190203；胰岛素样生长因子-1（IGF-1），纯度≥98%，货号PHG0078，购自美国Gibco 公司。

二、主要试剂和仪器

高糖DMEM 培养基、胎牛血清，均购自美国Gibco 公司；B 细胞淋巴瘤2 家族蛋白（Bcl-2）抗体、β-actin 抗体、Bcl-2 相关X 蛋白（Bax）抗体、活化胱天蛋白酶-3（Cleaved-caspase-3）抗体、mTOR 抗体、PI3K 抗体、Akt 抗体、羊抗兔二抗均购自艾博抗（上海）贸易有限公司。

BA400Digital 数码三目摄像显微镜为麦克奥迪实业集团有限公司产品，Image-Pro Plus 6.0 图像分析软件为美国Media Cybernetics 公司产品，SpectraMAX Plus384 酶标仪为美谷分子仪器有限公司产品，Cytoflex 流式细胞仪为美国贝克曼库尔特公司产品。

三、方 法

1.细胞培养

将已经冻存HeLa 细胞株快速在37 ℃下解冻后，加入适量高糖DMEM 完全培养基（10%胎牛血清+0.5%青链霉素双抗），调整细胞密度为1×10/mL，在37 ℃、5%CO的培养箱中连续培养72 h，中途更换完全培养基2～3 次，然后进行传代备用。

2.实验分组

浓度筛选试验：将细胞分成5 组（0、5、10、20 和40 μmol/L），药物干预48 h。机制检测试验：将细胞分为空白对照组、IGF-1 组（100 ng/L）、RDA 组（20 μmol/L）与联合用药组（IGF-1 100 ng/L+RDA 20 μmol/L），各组药物均干预48 h。

3. CCK-8 法检测细胞增殖率

待HeLa 细胞培养至生长对数期，加入胰蛋白酶进行消化，使用完全培养基制成单细胞悬液，将细胞密度调整为5×10/L，每孔取100 μL 细胞悬液加入到96 孔细胞培养板中，每孔加入100 μL 完全培养基，置于37 ℃、5%CO的培养箱中培养24 h。待细胞完全生长贴壁后弃去培养基，使用磷酸盐缓冲液清洗2 次。将RDA 溶于完全培养基，调整终浓度为0、5、10、20 和40 μmol/L，每孔加入200 μL 含RDA 培养基，置于37 ℃、5%CO的培养箱中培养48 h。药物干预48 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，继续在培养箱培养2 h，然后使用酶标仪测定在450 nm 波长下的吸光度值（A），以0 μmol/L 浓度的吸光度为对照值，根据公式计算培养48 h 的细胞增殖率，并计算半抑制浓度（IC），每组3 个复孔，结果取平均值。

4.流式细胞术检测细胞凋亡

将处于生长对数期的HeLa 细胞用完全培养基制成1×10/mL 的细胞悬液，每孔取1 mL 细胞悬液加入6 孔板中，37 ℃、5%CO条件下培养24 h使细胞生长贴壁，分别按照前述步骤分组培养HeLa 细胞48 h，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。每组3 个复孔，凋亡结果取平均值。

5.蛋白免疫印迹法检测各蛋白表达水平

分别按照前述步骤分组培养HeLa 细胞48 h，然后收集细胞行蛋白免疫印迹法检测细胞中Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3、磷酸化-PI3K（p-PI3K）、p-Akt、p-mTOR 蛋白的表达量，并计算蛋白相对表达量。每组3 个复孔，蛋白表达结果取平均值。

四、统计学处理

使用SPSS 25.0 分析数据。统计数据使用表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，多重比较采用Dunnett-t 检验；析因设计资料组间比较采用析因设计方差分析，交互效应有统计学意义时采用LSD-t 检验分析单独效应，P ＜ 0.05 表示差异具有统计学意义。

结 果

一、不同浓度RDA 对HeLa 细胞凋亡的影响

CCK-8 结果显示，与0 μmol/L 组相比，5 μmol/L 浓度以上RDA 对HeLa 细胞有抑制作用（P ＜ 0.05），抑制程度与RDA 浓度呈正相关，IC为20.90 μmol/L；细胞凋亡结果显示，5 μmol/L浓度以上RDA 对HeLa 有促进凋亡的作用（P ＜0.05），凋亡程度与RDA 浓度呈正相关，见图1、表1。

表1 不同浓度RDA 作用下HeLa 细胞的增殖率与凋亡率比较（，n=3）单位：%

图1 不同浓度RDA 干预后HeLa 细胞的凋亡情况

二、不同浓度RDA 对HeLa 细胞凋亡相关蛋白的影响

蛋白免疫印迹检测显示，与0 μmol/L 组相比，20、40 μmol/L 组中Bax 和Cleaved-caspase-3 的表达量均升高，Bcl-2 的表达降低（P 均＜ 0.05），0、5 μmol/L RDA 对HeLa 中Bcl-2、Bax、Cleavedcaspase-3 凋亡蛋白表达无明显影响，10 μmol/L RDA 对Cleaved-caspase-3 蛋白表达无明显影响（P均＞ 0.05），见图2、表2。

表2 不同浓度RDA 作用下HeLa 细胞中Bcl-2、Bax 及Cleaved-caspase-3 的蛋白相对表达量比较（±s，n = 3）

三、RDA 对HeLa 细胞PI3K/Akt/mTOR 信号通路的影响

蛋白免疫印迹检测显示，与0 μmol/L 组相比，10、20 和40 μmol/L 组3 种蛋白磷酸化表达量均降低（P 均＜ 0.05）。5 μmol/L 组3 种蛋白磷酸化表达量有降低趋势，但p-Akt 和p-mTOR 与0 μmol/L 组比较差异无统计学意义（P 均＞ 0.05），见图2、表3。综合前述结果，采用40 μmol/L 的RDA 进行后续实验。

表3 不同浓度RDA 作用下HeLa 细胞中p-PI3K、p-Akt 及p-mTOR 的蛋白相对表达量比较（±s，n = 3）

图2 不同浓度RDA 干预HeLa 后凋亡蛋白与PI3K/Akt/mTOR 信号通路蛋白的表达情况

四、激活PI3K/Akt/mTOR 通路后RDA 对HeLa 细胞的影响

检测与析因分析结果显示，IGF-1 和RDA 对细胞增殖率与凋亡率的主效应均有统计学意义，两者的交互作用对细胞增殖率（F = 11.028，P =0.006）与凋亡率（F = 48.494，P ＜ 0.001）有影响；估算边际平均值后发现RDA 对细胞增殖率与凋亡率影响明显，见表4。

表4 IGF-1 与RDA 对HeLa 细胞增殖率与凋亡率的效应分析（±s，n = 3） 单位：%

与空白对照组相比，IGF-1 组细胞增殖率与凋亡率无明显变化（P ＞ 0.05），RDA 组与联合用药组细胞的增殖率下降，凋亡率上升（P ＜ 0.05）；与IGF-1 组相比，RDA 组与联合用药组细胞的增殖率下降，凋亡率上升（P ＜ 0.05），RDA 组抑制HeLa 细胞增殖与促进凋亡的效果比联合用药组更明显（P ＜ 0.05），见表5、图3。

图3 激活PI3K/Akt/mTOR 信号通路后RDA 对HeLa 细胞凋亡的影响

表5 IGF-1 与RDA 对HeLa 细胞增殖率与凋亡率的影响（±s，n = 3） 单位：%

五、激活PI3K/Akt/mTOR 信号通路后RDA对HeLa 细胞中该信号通路蛋白表达的影响

析因分析结果显示，IGF-1 和RDA 对p-PI3K（F = 72.804，P ＜ 0.001；F = 23.819，P = 0.001）、p-Akt（F = 36.510，P ＜ 0.001；F = 5.317，P ＜0.001）、p-mTOR（F = 45.504，P ＜ 0.001；F =11.982，P = 0.009）的主效应均有统计学意义，两者的交互效应对p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 无影响（F = 0.272，P = 0.616；F = 1.291，P = 0.289；F =0.013，P = 0.912），估算平均边际值后发现RDA对p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 影响明显，见表6。故主要解析各因素的主效应作用，其中IGF-1 与RDA对HeLa 细胞的PI3K/Akt/mTOR 信号通路影响均有统计学意义，IGF-1 对PI3K/Akt/mTOR 信号通路为激活效应，而RDA 对PI3K/Akt/mTOR 信号通路表现抑制效应，见表7、图4。

图4 激活PI3K/Akt/mTOR 信号通路后RDA 对HeLa 细胞p-PI3K、p-Akt 及p-mTOR 蛋白表达的影响

表6 IGF-1 与RDA 对HeLa 细胞中PI3K/Akt/mTOR 信号通路蛋白表达效应分析（±s，n = 3）

表7 激活PI3K/Akt/mTOR 信号通路后RDA 对HeLa 细胞p-PI3K、p-Akt 及p-mTOR 蛋白的影响（±s，n = 3）

讨 论

研究表明，RDA 可在体外抑制多种肿瘤细胞的生长，如肝癌、乳腺癌、胃癌及卵巢癌等，说明RDA 有着强大的抗肿瘤活性。由此推测RDA对宫颈癌可能有一定的抗癌作用。本研究采用人宫颈癌HeLa 细胞进行体外试验，从细胞凋亡率和PI3K/Akt/mTOR 信号通路等方面探讨RDA 对人宫颈癌细胞的抑制作用。研究结果显示，5～40 μmol/L 的RDA 对HeLa 细胞均有抑制作用，且抑制效果与RDA 浓度呈正相关，初步显示RDA 对HeLa 细胞具有明显的抑制效果。

Caspase 是一组在细胞凋亡过程起关键作用的酶，而Bcl 家族在抑制Bcl-2 或促进Bax 导致细胞死亡的途径中也起着关键作用。本研究显示，5～40 μmol/L 的RDA 能对HeLa 细胞产生促凋亡作用，且作用随RDA 浓度的升高而增强，同时，20～40 μmol/L 的RDA 能使HeLa 细胞中的Bcl-2蛋白表达降低，Bax 和Cleaved-caspase-3 蛋白表达升高，这说明RDA 不仅对HeLa 细胞既有抑制增殖作用，也有促进凋亡作用。

PI3K/Akt/mTOR 信号通路广泛存在于多种细胞信号转导通路中，是目前恶性肿瘤研究的热点之一。该通路在肿瘤细胞的能量代谢、细胞增殖、侵袭能力、细胞凋亡和细胞周期等生理活动中发挥重要作用。PI3K/Akt/mTOR 信号通路在许多人类恶性肿瘤（包括宫颈癌）中异常激活。p-Akt和p-mTOR 蛋白在50%～53%的宫颈腺癌中均有表达，说明这2 种蛋白磷酸化过表达可能是导致宫颈癌的原因之一。本研究显示，使用RDA 干预HeLa 细胞后，p-PI3K、p-Akt 和p-mTOR 这3 种蛋白的相对表达量均降低，且抑制作用随RDA 浓度的升高而增强。由此说明，RDA 能通过抑制PI3K/AKT/mTOR 信号通路，降低HeLa 细胞增殖率。

IGF-1 通过活化Akt 激活下游信号通路，是胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）和PI3K/Akt 通路的强效刺激因子。有研究者发现，IGF-1 促进多种肿瘤细胞的有丝分裂、转移和抗凋亡，有助于肿瘤细胞的维持和促进肿瘤的进展。因此本研究探讨在PI3K/Akt/mTOR 信号通路激活的环境下，RDA 是否能发挥同样的抗癌效果。结果显示，IGF-1 和RDA 存在交互作用，RDA 的单独效应随IGF-1 变化，说明RDA 可能对IGF-1 诱导细胞增殖与抑制细胞凋亡的效果有抑制作用。与IGF-1 组相比，联合用药组能明显降低细胞增殖率且提高细胞凋亡率，但效果不如单用RDA，说明在IGF-1的干预下，RDA 仍然能发挥抑制肿瘤细胞生存的效果。进一步研究发现，IGF-1 和RDA 的交互作用并没有对p-PI3K、p-Akt 和p-mTOR 蛋白相对表达量产生影响，说明IGF-1 此时的作用只是单纯的PI3K/Akt/mTOR 信号通路激动剂，并未对RDA产生直接影响。与空白对照组相比，IGF-1 组的p-PI3K、p-Akt 和p-mTOR 蛋白相对表达量升高，说明IGF-1 激活了HeLa 细胞中的PI3K/Akt/mTOR信号通路。而RDA 能降低IGF-1 干预后p-PI3K、p-Akt 和p-mTOR 蛋白相对表达量，说明无论PI3K/Akt/mTOR 信号通路是处于正常状态还是异常激活状态，RDA 都能抑制HeLa 细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路中PI3K、Akt 和mTOR 蛋白的磷酸化，从而诱导HeLa 细胞死亡，阻止肿瘤细胞的增殖。

综上所述，RDA 能对人宫颈癌HeLa 细胞产生抑制增殖与促进凋亡的作用，其作用机制是通过抑制PI3K/Akt/mTOR 信号通路，降低p-PI3K、p-Akt 和p-mTOR 蛋白的表达，产生抗癌的效果。