管娟 肖素勤 陈玲 张敦宇 张云 程在全

摘要：【目的】鑒定和筛选获得云南粳型地方稻抗稻瘟病种质资源，明确其稻瘟病抗性及抗病基因分布，为合理利用水稻抗稻瘟病种质资源及其布局提供参考。【方法】采用病圃自然鉴定与人工接种相结合的方法，对150份云南粳型地方稻资源的稻瘟病抗性进行鉴定，并利用9个已克隆基因（Pid4、Pi25、Pi35、Pi36、Pikm、Pigm、Pi37、Pi56、Pi33）和2个已定位基因（Pi27、Pi23）对供试稻种资源进行基因型检测，明确抗病基因在抗稻瘟病材料中的分布。【结果】从150份水稻材料中共鉴定出抗稻瘟病（叶瘟或穗颈瘟）材料45份，45份材料中携带Pi25、Pi23、Pikm、Pi35、Pi36、Pi33、Pi27、Pi37、Pid4、Pigm抗性基因的材料分别有34份（75.6%）、25（55.6%）、25份（55.6%）、22份（48.9%）、14份（31.1%）、14份（31.1%）、12份（26.7%）、10份（22.2%）、6份（13.3%）和5份（11.1%），未检测到含有Pi56的材料。45份抗性材料含有的抗性基因数量介于1～7，大部分含有3～5个，其中携带3个抗性基因材料13份占28.9%，携带4个抗性基因材料8份占17.8%，携带5个抗性基因材料11份占24.4%。抗病能力较强的材料黑壳谷携带6个抗病基因（Pi25、Pi35、Pi36、Pikm、Pi37和Pi33），光壳花糯携带5个抗病基因（Pi35、Pi36、Pikm、Pi37和Pi33）。【结论】研究获得45份云南粳型抗稻瘟病地方稻材料，鉴定获得2份（黑壳谷和光壳花糯）全生育期抗叶瘟和穗颈瘟材料，这2份抗性材料均携带Pi35-Pi36-Pikm-Pi37-Pi33基因组合，可作为抗稻瘟病分子育种的优异抗源材料。

关键词： 水稻;稻瘟病;表型鉴定;基因分析;云南省

中图分类号： S435.111.41                         文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2022）01-0047-10

Evaluation of resistance to rice blast of japonica rice landrace resources in Yunnan

GUAN Juan1，2， XIAO Su-qin2， CHEN Ling2，ZHANG Dun-yu2，

ZHANG Yun2*， CHENG Zai-quan2*

（1 School of Resource Plants， Yunnan University， Kunming  650504， China; 2 Biotechnology and Germplasm

Resources Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming  650205， China）

Abstract：【Objective】Yunnan japonica rice blast resistant germplasm resources were obtained through identification and screening. Furthermore， the distribution of rice blast resistance genes in Yunnan japonica local rice resources were studied， which provided reference for rational utilization and distribution of rice blast resistance germplasm resources.【Method】The blast resistance of Yunnan japonica local rice resources was identified by natural identification in nursery and artificial inoculation. Rice blast resistance of 150 Yunnan japonica local rice resources was identified. Nine cloned genes （Pid4， Pi25， Pi35， Pi36， Pikm， Pigm， Pi37， Pi56， Pi33） and two localized genes （Pi27， Pi23） were used to detect the genotypes of the tested rice germplasms to determine the distribution of resistance genes in rice blast resistance materials. 【Result】A total of 45 rice materials resistant to rice blast （leaf blast or panicle neck blast） were identified from 150 rice materials. The numbers of resistant materials carrying resistance genes Pi25， Pi23， Pikm， Pi35， Pi36， Pi33， Pi27， Pi37， Pid4 and Pigm were 34 （75.6%）， 25 （55.6%）， 25 （55.6%）， 22 （48.9%）， 14 （31.1%）， 14 （31.1%）， 12 （26.7%）， 10 （22.2%）， 6 （13.3%） and 5 （11.1%）. No material containing Pi56 was detected. The number of resistance genes in 45 resistant materials ranged from 1 to 7， and most of them contained 3 to 5 resistance genes， including 13 materials carr-ying three resistance genes（28.9%）， 8 materials carrying 4 resistance genes（17.8%） and 11 materials carrying 5 resistance genes（24.4%）. Heikegu with strong disease resistance carried 6 resistance genes （Pi25， Pi35， Pi36， Pikm， Pi37 and Pi33）， and Guangkehuanuo carried 5 resistance genes （Pi35， Pi36， Pikm， Pi37 and Pi33）. 【Conclusion】In this study，45 japonica rice blast resistant materials in Yunnan were obtained. And 2 materials with resistance to leaf blast and neck blast were identified as Heikegu and Guangkehuanuo during the whole growth period they the gene combination of Pi35-Pi36-Pikm-Pi37-Pi33. This study can provide resistance source materials for molecular breeding and gene mapping of resistance to rice blast.

Key words： rice; rice blast; phenotypic identification; gene analysis; Yunnan

Foundation items： Yunnan Talents Special Project（YNWR-QNBJ-2018-284）; Project of Yan Long’an Academician Workstation of Yunnan（202005AF150032）; Graduate Research Innovation Project of Yunnan University（2020325）

0 引言

【研究意义】水稻（Oryza sativa L.）是全球约1/2人口的主粮。由子囊真菌（Magna-porthe oryzae）引起的稻瘟病被称为“水稻癌症”，其严重影响水稻产量和稻米品质，对世界粮食安全构成严重威胁。在25～28 ℃、空气湿度达96%的高温高湿环境下最易发生稻瘟病（张小花等，2021）。稻瘟菌具有遗传复杂性、致病多样性和变异高度性的特点，水稻品种经过长时间种植易丧失抗性而成为感病品种（Wilson and Talbot，2009;徐志健等，2020）。云南是水稻的起源和演化中心之一，具有丰富且遗传多样性水平高的稻种资源（陈越等，2019），由于特殊的地理隔离环境，这些资源外观表型差异大，长期的稻种隔离进化或演化，在多种多样病原菌的胁迫下，极易演化出多种多样的抗稻瘟病基因，是拓宽现代栽培稻抗稻瘟病遗传基础的重要资源。在云南省水稻品种审定中稻瘟病实行一票否决制。基于绿色发展理念，优化栽培管理措施、栽种抗稻瘟病品种是防治稻瘟病的有效手段（温小红等，2013），而开展水稻种质资源的抗病性评价，综合选育出适合当地栽培的高产优质抗病新品系（新品种），是水稻抗性资源利用的基础工作。抗病基因被挖掘、定位和克隆为水稻抗稻瘟病育种提供了丰富的抗源（殷得所等，2011）。利用基因序列信息，发展特异性功能标记，可快速检测品种的抗稻瘟病基因型（何重等，2014），对全面了解我国水稻抗稻瘟病的基因型及其合理布局与轮换具有重要意义。【前人研究进展】国内外对稻瘟病抗性基因已有较系统深入的研究，随着抗瘟基因定位、克隆及分子标记的发展，分子标记辅助育种的效率得以大幅度提高（王生轩等，2017）。近年来已从水稻种质资源中筛选和鉴定出一批优良的抗稻瘟病资源，并利用分子标记技术鉴定和定位出约100多个稻瘟病抗性基因（徐小金，2016），鉴定的抗稻瘟病QTLs有500多个（Li et al.，2019），其中已克隆37个NBS-LRR基因Pit、Pi37、Pish、Pi35、Pi64、Pib、Pi63、Pi2、Pi9、Piz-t、Pigm、Pid3、Pid3-A4、Pi25、Pi50、Pi36、Pi33、Pi5、Pii、Pi56、Pia、Pi-CO3911、Pi54、Pi54rh、Pi54of、Pik、Pi-1、Pikh、Pikm、Pikp、Pike、Piks、Pb1、Pi-ta、Pid4、rbr2）、Pi48（杨红等，2008;盛浩闻，2014;陈智雄，2018;Chen et al.，2018;高清等，2021）及6个其他结构类型基因bsr-d1（MYB转录因子）、pi21（富含脯氨酸蛋白）、Pid2（RLK）、bsr-k1（富含TPRs蛋白）、Ptr（富含ARM蛋白）、Pi65（LRR-RLK）（高清等，2021;Wang et al.，2021）。利用抗性基因的功能标记或紧密连锁分子标记，可准确地开展水稻种质资源抗稻瘟病基因型鉴定工作，已相继从云南地方稻资源中鉴定出一批含有抗稻瘟病基因的种质，如董丽英等（2012）利用由24个稻瘟病抗性单基因系组成的鉴别材料对云南稻区的稻瘟病菌群体致病性进行分析，结果发现Piz-t、Pi9和Pi5等基因是改良品种抗病性的重要基因源;在云南籼稻区对稻瘟病菌抗性频率高于80%的基因主要有Pi9、Pi5、Pik-h、Pita-2、Piz-5、Pita和Piz，在粳稻区对稻瘟病菌抗性频率高于80%的基因主要有Pi9、Pi5、Piz-t和Pi20;李进斌等（2012b）对云南省176份地方水稻品种进行Pita和Pib基因型检测，发现携带Pita或Pib基因的品种对稻瘟病的抗性较好;孙一丁等（2018）研究5个抗稻瘟病主效基因在云南省抗稻瘟病育种中的利用状况，用分子标记对云南省推广品种和优异地方稻种进行了分子检测，发现Pik-h、Pi5和Pita在地方品种中出现频率较高;马继琼等（2021）研究结果表明，Pib、Pikh、Piz、Pi9和Pi5等5个基因在云南籼粳稻交错区—温暖粳稻亚区具有广泛的利用价值。【本研究切入点】前人虽然已有对云南地方稻资源进行抗稻瘟病鉴定的报道，但往往仅限于单一的叶瘟或穗颈瘟鉴定;对材料既进行实验室和田间自然鉴定、又进行苗期和孕穗期接菌鉴定的较少见，且云南地方稻材料中是否携带9个已克隆基因Pid4、Pi25、Pi35、Pi36、Pikm、Pigm、Pi37、Pi56、Pi33和2个已定位基因Pi27、Pi23的研究尚未可知。【拟解决的关键问题】采用多种表型鉴定与基因型鉴定相结合的方法，对150份云南粳型地方稻抗稻瘟病及其所携带9个已克隆基因（Pid4、Pi25、Pi35、Pi36、Pikm、Pigm、Pi37、Pi56、Pi33）和2个已定位基因（Pi27、Pi23）情况进行鉴定，明确供试云南粳型地方稻资源的稻瘟病抗性及本研究所检测基因的分布，以鉴定和筛选获得云南粳型地方稻抗稻瘟病种质资源，為合理利用水稻抗稻瘟病种质资源及其布局提供参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试水稻材料为云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所提供的150份来源于云南16个州（市）的粳型地方稻资源，以蒙古稻为诱发材料，以感病品种丽江新团黑谷为阴性对照。供试稻瘟病菌菌株：供试菌株8个，为云南强致病稻瘟病菌株491、66b、540、129、179、463、YN355和226，由云南省农业科学院环境资源研究所杨勤忠老师和云南农业大学植物保护学院李成云老师提供。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 稻瘟病菌培养和孢子悬浮液制备 分别采用PDA培养基（Liu and Stützel，2004）（去皮马铃薯200 g、葡萄糖10 g、琼脂15 g、蒸馏水1000 mL）和番茄燕麦产孢培养基（张国珍等，2002）（燕麦片40 g、番茄汁150 mL、琼脂20 g、蒸馏水1000 mL）进行稻瘟病菌菌丝培养及孢子培养。制备稻瘟病菌孢子悬浮液时，先在产孢的培养皿中加入5 mL灭菌水，用棉签或载玻片刮洗，洗下培养基表面的分生孢子，过滤收集孢子悬浮液，菌液用纱布（或专用滤布）过滤，滤液在100倍显微镜下观察有20～50个孢子时可供苗期喷雾接菌和孕穗期注射接菌使用（李进斌等，2012a）。

1. 2. 2 稻瘟病菌的苗期接种鉴定 将供试水稻材料浸种至露白，分批播于50孔加深育苗盘（54.0 cm×28.0 cm×9.5 cm）中，以丽江新团黑谷为感病对照，每个材料播种16株，2.5叶期每盘施0.5 g尿素（李进斌等，2012a），1 d后追施第2次，施肥7 d后用加入0.2% Tween-20的混合菌悬浮液（66b、129、491、179、463、226、540和YN355）进行喷雾接种（夏小东等，2011）。接种后的稻苗置于26～28 ℃、湿度95%的人工气候箱中暗处理24 h，随后在12 h光照∶12 h黑暗、温湿度保持不变的环境下培养，7 d后进行调查。

1. 2. 3 稻瘟病菌的自然诱发鉴定和接种鉴定 在云南省玉溪市易门县实验基地田间自然诱发鉴定圃对参试材料进行苗期和孕穗期自然诱发鉴定及孕穗期人工注射接种鉴定。

人工接种鉴定时考虑到8个菌工作量较大，因此只用3个致病菌株491、66b和540在参试材料孕穗期时对破肚前3～4 d的穗包进行人工注射接菌法鉴定穗颈瘟。每个菌株分别接种10株，每穗接种5～10 mL菌液，接种20 d或成熟后进行调查。

1. 2. 4 发病调查标准 参照国际水稻研究所叶瘟抗性评价分级标准对发病情况进行调查，按照病情指数=∑（各级病株数×该病级值）/（调查总株数×最高级值）×100进行病情指数计算。病情指数为0表示高抗（HR），0～5.0%为抗（R），5.1%～15.0%为中抗（MR），15.1%～25.0%为中感（MS），25.1%～50.0%为感（S），≥50.1%为高感（HS）（何奕霏等，2021）。人工注射接种鉴定穗颈瘟参考GB/T 15790—2009《稻瘟病测报调查规范》制定的稻瘟病9级（以穗为单位）标准进行调查（董丽英等，2018），计算出穗平均损失率后对应9级发病等级。注射接种鉴定抗1～3个接种稻瘟病菌株记为抗，感3个菌株时记为感。

1. 2. 5 抗性基因的分子标记检测 在水稻分蘖期或拔节期，取新鲜水稻叶片用试剂盒的方法提取DNA。抗性基因分子标记序列见表1，PCR检测方法参照表1的相关文献。以丽江新团黑谷为阴性对照，引物均由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

1. 3 统计分析

采用Excel 2016对数据进行整理和作图。采用SPSS 23.0对不同水稻品种含有的抗瘟基因数与抗性频率间的相关性进行分析。

2 结果与分析

2. 1 稻瘟病表型鉴定结果

自然誘发和人工接种鉴定结果显示蒙古稻和丽江新团黑谷发病均达9级，表明试验结果数据可靠。叶瘟发病情况如图1～图3，以自然诱发和喷雾接菌均中抗及以上的材料记为抗叶瘟，反之记为感叶瘟。自然诱发鉴定出抗叶瘟材料5份、中抗材料56份、中感材料53份、感病材料32份、高感材料4份;室内人工接种鉴定共鉴定出抗叶瘟材料2份、中抗材料22份、中感材料63份、感病材料63份。综合自然诱发和人工喷雾2种方法接种鉴定叶瘟，共鉴定出叶瘟发病等级在0～4级、病情指数在15%以下的抗叶瘟材料8份。

穗颈瘟鉴定结果（图4），自然诱发鉴定发现高抗材料6份，抗病材料28份，中抗材料46份，中感材料29份，感病材料20份，高感材料21份。注射接种鉴定发现150份供试材料中同时抗491、66b和540菌株的材料7份;抗2个菌株的材料18份，其中抗491和540菌株的材料8份，抗66b和540菌株的材料5份，抗491和66b菌株的材料5份;只抗1个菌株的材料43份，其中只抗491菌株的材料13份，只抗66b菌株的材料12份，只抗540菌株的材料18份;不抗3个菌株的材料82份。综合自然诱发鉴定和人工注射接种鉴定结果，自然诱发鉴定在0～3级且至少抗1个接种稻瘟病菌株的材料统计为抗穗颈瘟，共鉴定出抗穗颈瘟材料39份。

综合叶瘟和穗颈瘟鉴定结果，共筛选出表型抗稻瘟病（叶瘟或穗颈瘟）材料45份，感稻瘟病材料105份。45份抗稻瘟病材料中抗穗颈瘟、感叶瘟材料37份，占供试材料的24.7%，抗叶瘟、感穗颈瘟材料6份，占供试材料的4.0%，既抗叶瘟又抗穗颈瘟材料2份（黑壳谷和光壳花糯），占供试材料的1.3%，该2份材料可作为抗稻瘟病育种优异抗性亲本（表2）。

2. 2 抗性基因在参试水稻材料中的分布

对从云南粳型地方稻材料中筛选出的45份表型抗叶瘟或穗颈瘟材料进行分子标记检测，根据11个抗稻瘟病基因的特异性功能标记或紧密连锁分子标记进行PCR扩增，以丽江新团黑谷为阴性对照，以谷梅4号为Pigm基因的阳性对照（Deng et al.，2006），分析11个基因及其同源基因在45份材料中的分布情况。结果表明，携带Pi25、Pi23、Pikm、Pi35、Pi36、Pi33、Pi27、Pi37、Pid4和Pigm抗性基因的抗性供试材料分别有34份（75.6%）、25份（55.6%）、25份（55.6%）、22份（48.9%）、14份（31.1%）、14份（31.1%）、12份（26.7%）、10份（22.2%）、6份（13.3%）和5份（11.1%）。在45份供试抗性材料中，11个抗性基因的分布以 Pi25、Pi23和Pikm最多，Pid4和Pigm较少，未检测到含Pi56的材料。没有材料同时含有11个检测抗性基因，也没有材料不含任何抗性基因。

2. 3 携带抗性基因数量与水稻的抗病性

45份抗性材料含有的抗性基因数量介于1～7个，大部分含有3～5个，其中携带1个抗性基因的材料2份占4.4%，携带2个抗性基因的材料7份占15.6%，携带3个抗性基因的材料13份占28.9%，携带4个抗性基因的材料8份占17.8%，携带5个抗性基因的材料11份占24.4%，携带6个抗性基因的材料3份占6.7%，携带7个抗性基因的材料1份占2.2%。抗病能力较强的材料黑壳谷携带6个抗病基因（Pi25、Pi35、Pi36、Pikm、Pi37和Pi33），光壳花糯携带5个抗病基因（Pi35、Pi36、Pikm、Pi37和Pi33）（表3）。

参试材料的抗病性大致随着携带抗性基因数量的增多呈上升趋势。利用SPSS 23.0对45份材料携带抗性基因数量与叶瘟、穗颈瘟抗性水平（R记为1，S记为0）进行Pearson相关性分析，结果显示抗性基因数量与叶瘟和穗颈瘟抗性水平的相关系数分别为0.133和0.019，表明携带的抗性基因数量与叶瘟和穗颈瘟抗性水平均无显著相关（P>0.05）。

3 讨论

研究表明，培育广谱持久抗稻瘟病品种和抗病品种合理布局是绿色防控稻瘟病最经济、有效的措施，而开展稻瘟病抗性品种鉴定是筛选优良抗病品种和抗瘟基因的重要基础。本研究从150份云南粳型地方稻材料中综合鉴定获得45份抗性种质资源，其中，抗穗颈瘟材料39份，抗叶瘟材料8份，既抗叶瘟又抗穗颈瘟材料2份，为黑壳谷和光壳花糯。本研究鉴定的抗稻瘟病资源对云南现有稻瘟病菌具有显著抗性，可作为稻瘟病育种和抗病基因研究的优异抗源材料。因水稻品种抗病性差异、稻瘟病生理小种侵染能力强弱、抗病鉴定生态区不同和气温年际间差异等，在稻种资源叶瘟抗性与穗颈瘟抗性关系的研究结果中有一定差异，叶瘟抗性变化较穗颈瘟大（陈福如等，2006）。本研究发现水稻的叶瘟抗性与穗颈瘟抗性并非一一对应，感叶瘟的材料到后期不一定就感穗颈瘟，与殷春渊等（2017）的研究结论一致。从整个表型鉴定结果来看，筛选出的抗叶瘟材料少于抗穗颈瘟材料，可能是因为叶瘟与穗颈瘟鉴定试验的严格程度、接种环境和接种菌株数量的不同而导致。与穗颈瘟田间鉴定相比，叶瘟鉴定是在严格控温控湿的人工气候室内喷雾接种8个菌株的混合菌悬液，不但人为控制了发病条件，而且喷雾接种的菌株数量比注射接种的菌株数量多。

一定程度上，聚合多个抗性基因有利于拓宽品种的抗谱，提高材料的抗病性，可作为培育稻瘟病持久抗性的有效方法（张银霞等，2016）。但携带基因数量不是影响抗性的唯一因素，供试材料来源、遗传背景、基因组合类型和聚合方式以及基因之间的互作均会影响稻瘟病抗性（邓钊等，2022）。王丽丽等（2017）研究认为抗瘟基因聚合与抗病性并非完全正相关，本研究对不同抗稻瘟病基因的抗病效应进行相关性分析，发现抗性基因数量与材料的稻瘟病抗性无显著相关，即表型抗感与携带抗性基因个数并非一一对应关系。其中，从2份抗叶瘟和穗颈瘟材料（黑壳谷和光壳花糯）发现Pi35-Pi36-Pikm-Pi37-Pi33基因组合在本研究中表现抗病能力最强，黑壳谷比光壳花糯多携带1个抗瘟基因Pi25，但表型抗叶瘟和穗颈瘟能力弱于光壳花糯，说明抗稻瘟病基因间的互作关系十分复杂，抗稻瘟病基因的聚合在一定程度上能提高水稻抗性，但水稻抗瘟能力的提高并不是简单的抗瘟基因疊加的结果。因此，对抗稻瘟病水稻亲本的选择，应从田间筛选出抗病性较强的亲本作为抗稻瘟病育种的候选亲本。

4 结论

通过表型鉴定与基因分析相结合的方法从150份来自云南多地的粳型地方稻资源进行抗稻瘟病分析，鉴定出表型抗稻瘟病（叶瘟或穗颈瘟）材料45份，其中黑壳谷和光壳花糯2份材料在表型鉴定中既抗叶瘟又抗穗颈瘟，携带Pi35-Pi36-Pikm-Pi37-Pi33基因组合的抗病能力最强，可作为抗稻瘟病分子育种的优异抗源材料。

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（責任编辑 麻小燕）