沈朝壮 沈萍萍 王晓虎 李 超 谢海棠

慢性肾衰竭(Chronic renal failure, CRF)是由于各种慢性肾脏疾病未得到有效控制，发展到后期所导致的临床综合征，可引起不可逆的肾脏功能损害[1]。以血肌酐、尿素氮等生化指标异常、肾小球滤过率下降、代谢毒物蓄积、水和电解质及酸碱失衡等为主要表现，从而导致机体神经、内分泌、循环、消化系统等脏器功能衰竭。

真武汤源于《伤寒论》，由君药附子，臣药茯苓、白术，佐药白芍、生姜五味中药按比例炮制而成，具有温肾利水、回阳燥湿之功效。相关研究常用真武汤治疗CRF、糖尿病肾病、慢性肾小球肾炎、肾病综合征等各种肾脏疾病。

中药复方具有“多组分、多靶点”的特点，传统方法很难对整个复方进行系统的探讨。网络药理学强调从系统层次和网络大数据的整体角度出发，分析药物对疾病潜在的治疗机制，为中药复杂体系研究提供了新思路。我国在最新发布的首个《网络药理学评价方法指南》[2]中对网络药理学的具体评价要求作出详细的阐述。本研究利用网络药理学结合分子对接的方法探讨真武汤治疗CRF的分子作用机制，为真武汤的进一步研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 药物有效成分及靶点筛选

利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，https://tcmsp-e.com)数据库检索真武汤中五味单药的有效成分，以类药性(DL)≥0.18，口服生物利用度(OB)≥30%为筛选条件，筛选出主要有效成分。根据筛选结果查询相关靶点汇总，并将所有靶点导入Uniprot(https://www.uniprot.org)数据库中查询基因名进行匹配。

1.2 有效成分-靶点网络构建

将药物、有效成分、靶点等信息进行汇总分类构建有效成分-靶点网络。将其导入Cytoscape 3.8.2软件进行“Analyze Network”分析，根据各节点Degree值对网络进行优化。

1.3 CRF相关靶点筛选

以“chronic renal failure”“chronic kidney failure”为关键词，挖掘OMIM(https://omim.org)，Drugbank(https://go.drugbank.com)，Genecards(https://www.genecards.org)，CTD(http://ctdbase.org)数据库中CRF靶点。将各数据库筛选出的疾病靶点根据Score值进行排序，Score值越大代表靶点与疾病越相关，并以Score值的中位数为基准[3]，多次取大于中位数的靶点，4个数据库中所筛选得到的靶点汇总。

1.4 PPI网络构建

将真武汤主要有效成分靶点与CRF靶点取交集，得到的交集靶点导入STRING11.0(https://www.string-db.org)数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein interaction, PPI)网络。物种类别设置为“Homo sapiens”，阈值为“medium confidence(0.400)”，构建PPI网络并隐藏网络中无连接的节点。将构建好的PPI网络导入Cytoscape 3.8.2软件优化，使用MCODE插件找出PPI网络中的核心靶点子网络，选取Score值最大的子网络。将该子网络中所有靶点在有效成分-靶点网络中相关联的有效成分找出并进行分析。

1.5 KEGG、GO富集分析

为进一步探讨交集靶点中可能涉及的信号通路、生物进程(Biological process，BP)、细胞组分(Cellular component，CC)、分子功能(Molecular function，MF)等信息，将交集靶点导入DAVID(https://david.ncifcrf.gov)数据库进行KEGG和GO分析。设置标识符为“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”,物种为“Homo sapiens”进行分析，数据按P-value值进行排序，最终设定阈值为P<0.01，筛选相关信息。

1.6 药物-靶点-通路-疾病网络

将处理后的药物、有效成分、靶点、信号通路、疾病数据文件导入Cytoscape 3.8.2软件进行分析，根据各节点Degree值、介度(Betweenness Centrality)及紧密度(Closenesss Centrality)等网络拓扑学参数筛选出起主要药效作用的成分。将结果与PPI网络结果进行对比，找出两网络筛选出的共同的有效成分及靶点。

1.7 分子对接验证

综合上述网络筛选出成分和靶点进行分子对接。使用RCSB PDB(https://www.rcsb.org)数据库，根据分辨率(Resolution)及相关性排名选取靶点蛋白骨架，下载“pdb”文件。使用TCMSP数据库下载有效成分的分子结构“mol2”文件。用AutoDock Vina软件进行分子对接，选取结合能最优的构象与靶点蛋白对接并保存对接后的复合物文件，将复合物文件导入Python-Pymol 2.5.0进行最终优化。

2 结果

2.1 有效成分及靶点筛选

从TCMSP数据库经过筛选后得到真武汤中总的有效成分59种，包含附子21种，茯苓15种，白术7种，白芍13种，生姜5种，其中附子和白芍共有成分1种(谷甾醇)，白芍和生姜共有成分1种(β-谷甾醇)。查询筛选出的有效成分靶点中附子30个，白芍123个，茯苓30个，白术23个，生姜75个，将其导入Uniprot数据库转化成基因名，删除未查询到基因名的靶点及重复值，最后保留有效成分靶点95个。

2.2 有效成分-靶点网络构建

将药物、成分、靶点导入Cytoscape 3.8.2软件构建有效成分-靶点网络，见图1。该网络由126个节点和236条边构成。Degree值最高的前3个成分为山奈酚、β-谷甾醇和豆甾醇，且大多有效成分对应2个以上靶点，说明真武汤是多组分，多靶点共同作用的结果。

图1 有效成分-靶点网络

2.3 交集靶点筛选

挖掘OMIM、Drugbank、Genecards、CTD数据库中CRF靶点，得到2 964个靶点，将筛选出的药物靶点与疾病靶点取交集，见图2。结果得到交集靶点70个。

图2 疾病靶点“venn”图(A)及药物-疾病靶点“venn”图(B)

2.4 PPI网络构建

将70个交集靶点导入STRING11.0数据库构建PPI网络，隐藏1个无相互作用的节点(SCN5A)后导入Cytoscape 3.8.2软件进行优化，该网络有69个节点，547条边构成。利用MCODE插件找出PPI网络中的核心靶点子网络，选择Score值最大(17.684)的子网络，见图3。该子网络有20个节点和168条边，共对应着20个核心靶点。根据有效成分-靶点网络，找出与核心靶点相关联的有效成分并统计。结果显示，与20个核心靶点相关的有效成分出现频次最多的为山奈酚、β-谷甾醇、芍药苷等。

图3 PPI网络

2.5 KEGG、GO富集分析

将交集靶点导入DAVID数据库进行富集分析，以P<0.01作为阈值进行筛选。共有88条信号通路满足要求，主要涉及TNF、Toll样受体、NF-κB、HIF-1等信号通路，选择前20条通路做图；GO_BP结果共有121个条目，主要涉及对药物的反应、对脂多糖的反应、对雌二醇的反应等生物进程；GO_CC结果共有21个条目，主要有膜筏、膜小窝、细胞溶质等细胞组分；GO_MF结果共有36个条目，主要涉及酶结合、蛋白质同型二聚体活性、类固醇激素受体活性等分子功能。3种GO分析结果均取前10个条目作图。汇总结果见图4。

图4 KEGG和GO富集图

2.6 药物-靶点-通路网络

找出前20条通路对应靶点，以及靶点对应有效成分，导入Cytoscape 3.8.2软件作图，结果见图5。该网络有71个节点和284条边，根据Degree值、介度及紧密度等网络拓扑学参数进行分析，找出可能起药效作用的主要成分及核心靶点。结果显示可能起药效作用的主要成分为山奈酚、β-谷甾醇、芍药苷等。找出前20个核心靶点，与PPI网络的前20个核心靶点对比，有13个共同靶点，找出2个网络筛选的核心靶点所相关联的有效成分，2个结果都提示山奈酚、β-谷甾醇、芍药苷可能是起主要药效作用的有效成分。

图5 药物-靶点-通路网络

2.7 分子对接验证

根据Degree值及频数综合选取两网络筛选靶点进行分子对接，选取结果及其结合能见表1。一般认为受体和配体的结合能≤-5.0 kcal·mol-1说明两者有较好的结合活性，结合能≤-7.0 kcal·mol-1可认为其具有强结合活性[4]。将对接结果导入Python-Pymol 2.5.0进行最终的可视化，见图6。

表1 分子对接结果数据

图6 分子对接图

3 讨论

真武汤属温阳利水之方，主治阳虚水泛之症，被收录于《古代经典名方目录(第1批)》，其复方中附子为君药，温阳驱冷；茯苓、白术为臣药，健脾燥湿；白芍和生姜为佐药，化湿利水，所以临床上多采用真武汤治疗CRF。

结果显示山奈酚、芍药苷、β-谷甾醇分别与AKT1、TNF、IL6、MAPK8、RELA、TGFB1等靶点显著相关。山奈酚属于天然黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗癌、改善微循环、矫正受损代谢通路等作用[5]，相关研究表明其可通过抑制NF-κB因子水平、调控MAPK信号通路等途径来发挥抗炎抗氧化作用，以此来改善肾功能[6-7]。β-谷甾醇是一种天然植物类甾醇，是多种中药的重要成分，相关研究已证明其具有抗炎抗氧化等作用[8]。SHARMILA等[9-10]在相关研究中发现β-谷甾醇可通过激活NRF-2的抗氧化酶活性降低肾毒性小鼠的血肌酐、尿素、尿酸及iNOS表达水平，且在针对肾癌小鼠的相关试验中，发现β-谷甾醇可以降低CYCLIN-D1、PCNA等蛋白表达水平，增高CAS及BAX表达水平，提示其可以通过诱导癌细胞凋亡，抑制癌细胞增殖及血管生成达到改善肾癌的相关作用。芍药苷是一种单萜类糖苷化合物，是白芍总苷中的主要活性成分。在对芍药苷的相关研究中，发现其可通过调节TLR2、TLR4等信号通路来改善糖尿病肾病大鼠的肾功能[11]。

AKT1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，该蛋白参与多种生物学过程，包括代谢、增殖、细胞生长、血管生成等，是急性肾损伤转化为慢性肾脏疾病的相关治疗靶点[12]。山奈酚可通过PI3K/Akt介导的相关信号通路抑制氧化应激和细胞凋亡[13]；TNF与IL6属炎症因子，参与全身的炎症，相关研究表明其在加速肾小球硬化的过程中起到重要作用[14]。山奈酚和芍药苷可通过调节TNF和IL6因子水平改善炎症，起到抗炎作用[15-16]；MAPK8又称丝裂原激活蛋白激酶8，相关研究也表明调节其水平的变化可减轻细胞外基质积聚进而发挥肾脏保护作用[17]。有研究发现山奈酚抑制类风湿性关节炎成纤维细胞样滑膜细胞的迁移和侵袭，是通过阻断该通路的激活而起作用的[18]；RELA属NF-κB/Rel家族成员，ZHAO等[19]在研究肾脏中的Klotho激素水平与糖尿病肾病炎症的关系时，发现其可通过调节RELA相关靶点通路改善肾功能；PTGS2是前列腺素生物合成中的关键酶，可促进血管生成，抑制细胞凋亡。PTGS2基因可编码环氧合酶2(COX-2)，COX-2与炎症、维持钠和水的平衡、控制肾素释放、肾血管扩张、血管收缩减弱和产前肾脏发育有关，在肾衰竭期间，COX-2的mRNA和蛋白水平以及酶活性都会随着前列腺素E2的增加而增加[20]。

KEGG通路富集分析显示，真武汤治疗CRF与调节TNF、Toll样受体、NF-κB、HIF-1等信号通路有关。TNF信号通路主要与细胞的分化、凋亡和炎性反应的诱发有关，TNF-α 拮抗药可改善肾脏炎症并减少蛋白尿[21]。Toll样受体是一类重要的蛋白质分子，常参与非特异性免疫过程，在治疗急性肾损伤时有多方面作用[22]。NF-κB通路在细胞的炎症反应、免疫应答等过程中起到关键性作用，CHENG等[23]研究表明肝细胞生长因子可通过NF-κB通路治疗Ⅱ型糖尿病诱导的慢性肾功能衰竭。HIF-1又称低氧诱导因子，孙静等[24]研究表明真武汤可通过上调HIF-1α的表达保护肾小管上皮细胞的缺氧损伤。

本研究利用网络药理学的方法，从药物、有效成分、靶点、通路等方面系统的阐述了真武汤治疗CRF的作用机制，将多种分析结果合并讨论筛选，最终筛选出可能起主要作用的成分及靶点，方法较为完整，且筛选结果大多有相关文献支持。后续研究仍需继续对筛选结果进行下一步探索，可以真武汤中单体成分为主要研究对象，针对筛选靶点进行动物或细胞试验，为基础研究和临床用药提供依据。