刘玲玲,李冰宁,杨梦奇,杨明,武彦文*

1(北京市科学技术研究院 分析测试研究所(北京市理化分析测试中心),北京,100094)2(北京市食品安全测试工程技术研究中心,北京,100094)

自从2008年欧洲进口的乌克兰葵花籽油被矿物油污染的事件发生之后[1],欧盟对各类食品中的矿物油污染情况一直非常重视,先后出台了“食品中矿物油的科学意见”[2]、国际标准ISO 17780—2015《动植物油脂 植物油中脂肪烃的测定》和欧盟标准EN 16995—2017《植物油和植物油基食品中饱和烃和芳香烃矿物油的测定》以及相关监管规范[3]。根据欧洲食品安全局(European Food Safety Authority,EFSA)的规定,矿物油是石油和合成油及其精炼产品,包含n-C10～n-C50碳氢化合物,可分为饱和烃矿物油(mineral oil saturated hydrocarbons,MOSH)和芳香烃矿物油(mineral oil aromatic hydrocarbons,MOAH)2类[2]。矿物油可以通过原料、生产、包装、运输整个产业链迁移污染食品[2,4-5],因而欧盟呼吁世界各国广泛收集矿物油污染数据[6]。然而,目前的调查尚不充分[7-8],我国的调查更少;并且现有数据主要集中于食用油、巧克力、奶粉、大米、饼干、面包等[7,9-15],对饮料酒的关注很少。CASTLE等[16]采用GC测定啤酒中的矿物油,以考察包装材料的迁移情况,结果因方法的定量限过高(0.1 mg/kg)而未检出[16];JICKELLS等[17]采用GC分析了105个葡萄酒样品,目的是考察瓶塞涂抹矿物油蜡的迁移情况,结果也因方法的定量限太高(0.2 mg/L)而未检出。

由于矿物油能溶于乙醇,因而高酒精度(乙醇体积分数)酒可能会有矿物油污染。我国的白酒酒精度(30%～70%)远高于文献报道的啤酒(1%～8%)和葡萄酒(7%～18%)[18-19],因此有必要了解白酒的矿物油污染情况。本文采用高效液相色谱-气相色谱联用(HPLC-GC)技术,通过GC分离柱之前的保留间隙柱、三通和溶剂挥发出口,实现大体积进样,将常规GC的分析灵敏度提高了100多倍[20-21]。

基于上述分析,本文首先优化了不同酒精度饮料酒的提取方法,然后通过HPLC-GC建立了白酒、葡萄酒和啤酒中的MOSH和MOAH的高灵敏测定方法,最后应用该方法调查了部分市售饮料酒产品的矿物油含量,并且分析了矿物油与酒精度、包装材料的关联性,以探究其污染来源。

1 材料与方法

1.1 样品

收集了北京市场上的17个饮料酒,其中白酒9个(A1～A9)、葡萄酒(B1～B4)和啤酒(C1～C4)各4个,样品的酒精度和包装信息见表1。

1.2 试剂与标准品

正己烷、二氯甲烷和无水乙醇均为色谱纯试剂,美国Fisher Scientific公司;无水硫酸钠(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;2种混合标准溶液：含有9种化合物的MOSH/MOAH混合标准溶液,北京坛墨质检科技有限公司,其中正十一烷(n-undecane,n-C11)、环己基环己烷(bicyclohexyl,Cycy)、戊基苯(amylbenzene,5B)、1-甲基萘(1-methylnaphthalene,1-MN)、2-甲基萘(2-methylnaphthalene,2-MN)、1,3,5-三叔丁基苯(1,3,5-tri-tert-butylbenzene,TBB)的质量浓度均为300 mg/L,正十三烷(n-tridecane,n-C13)的质量浓度为150 mg/L,胆甾烷(5-alpha-cholestane,Cho)和苝(perylene,Per)的质量浓度为600 mg/L。自行配制碳数保留时间混合标准溶液,其中正构烷烃标准品购自美国Restek公司,溶液中含有n-C10、n-C11、n-C13、n-C16、n-C20、n-C24、n-C25、n-C35、n-C40、n-C50各100 mg/L,用于划分碳数范围。

1.3 仪器与设备

HPLC-GC联用仪器由3部分组成：LC 20AD液相色谱仪(配备紫外检测器)、2010 plus气相色谱仪(配备FID检测器),日本岛津公司;HPLC-GC接口,德国Axel Semrau公司。R-100旋转蒸发仪,瑞士步琦有限公司;HeraeusMegafuge 8离心机,美国Fisher Scientific公司。

1.4 实验方法

1.4.1 提取与浓缩

取20 mL白酒置于玻璃离心管中,加入10 μL的MOSH/MOAH混合标准溶液,加入10 mL正己烷振荡1 h,然后加入10 mL去离子水,离心取上清液,以无水硫酸钠除去水分,旋转蒸发浓缩至约1 mL,供HPLC-GC分析。

取20 mL啤酒和葡萄酒样品(啤酒和起泡葡萄酒超声脱气10 min)置于玻璃离心管中,加入10 μL的MOSH/MOAH混合标准溶液,加入20 mLV(正己烷)∶V(乙醇)=1∶1混合试剂振荡1 h,离心取上清液,以无水硫酸钠除去水分,旋转蒸发浓缩至约1 mL,供HPLC-GC分析。

1.4.2 HPLC-GC分析

1.4.2.1 HPLC条件

采用Restek Allure Si(250 mm×2.1 mm,5 μm)色谱柱。流动相A为正己烷,流动相B为二氯甲烷,采用梯度洗脱程序：0～0.1 min,100% A(流速为0.3 mL/min);0.1～6.2 min,70%A(流速为0.3 mL/min);6.2～15.2 min,100% B(反冲,流速为0.5 mL/min);15.2～25.2 min,100% A(流速为0.5 mL/min);25.2～30 min,100% A(流速为0.3 mL/min)。进样量为100 μL。采用紫外分光光度计(230 nm)监测HPLC的流动相与MOAH流出情况。

1.4.2.2 HPLC-GC接口

经HPLC分离得到MOSH(2.0～3.5 min)和MOAH(4.5～6.0 min)2段流分,通过阀切换导入GC,以保留间隙与溶剂挥发出口完成大体积进样。

1.4.2.3 GC条件

GC仪器配置两套完全相同的通道,每个通道均采用Restek MXT(10 m×0.53 mm)无涂层毛细管预柱和Restek MXT-1(15 m×0.25 mm×0.25 μm)分析柱,保留间隙柱与分析柱之间通过三通与溶剂排出阀连接;程序升温为初始温度60 ℃,保持6 min,以15 ℃/min升温至120 ℃,再以25 ℃/min升温至370 ℃,保持6 min;氢火焰离子化检测器(flame ionization detector,FID)温度为380 ℃;载气为氢气(纯度≥99.995%),MOSH和MOAH通道的初始压力分别为80和79 kPa;辅助气、燃烧气和助燃气分别为氮气、氢气和空气,流速分别为30、40、400 mL/min。

1.4.3 数据分析

MOSH和MOAH的GC谱图呈跨越一定沸程范围的驼峰,定量计算时,MOSH/MOAH的含量通过积分计算基线与驼峰之间的面积得到,基线由空白实验获得;驼峰上方的尖峰需要扣除[20-21]。内标法定量：MOSH的内标物为Cycy,MOAH的内标物为2-MN。

2 结果与分析

2.1 提取

2.1.1 提取溶剂

基于相似相溶原理,以弱极性溶剂提取矿物油。通常,为了匹配HPLC-GC分析,常用正己烷作提取溶剂[20]。因此,饮料酒中的矿物油提取是一个液液萃取过程。由表1可知,白酒的酒精度最高,含量在40%～68%;其次是葡萄酒,酒精度为11%～14.5%;啤酒的乙醇体积分数仅为3.3%～5%。因此,饮料酒中的矿物油的提取方法实际上就是根据样品中的乙醇含量,匹配出最优的正己烷-乙醇-水溶剂体系,以达到最好的矿物油提取效果。

由于白酒的酒精度中位值为52%,因而可以粗略认为其V(乙醇)∶V(水)=1∶1,即20 mL白酒中乙醇和水均为10 mL。通常,为了达到最佳萃取效果,水-乙醇-正己烷溶剂体系体积比应接近2∶1∶1[20]。因此,提取白酒中的矿物油需要添加10 mL正己烷和10 mL水。同样地,葡萄酒和啤酒中的乙醇含量较低,可以粗略认为由水组成,可在20 mL 2种发酵酒中添加10 mL正己烷和10 mL乙醇进行提取。

2.1.2 提取级数

以样品A1为例,分别比较了提取1次和2次的分析结果(表2)。结果表明,2次提取的MOSH含量仅比提取1次的增加了2.7%,说明1次即可将绝大部分矿物油提取出来。考虑到提取2次消耗的时间和溶剂均增加1倍,因此确定提取级数为1次。

表2 提取次数对同一样品中MOSH(n-C10～C50)测定的影响(n=3)

2.2 方法学考察

2.2.1 定量限

HPLC-GC的检测器为FID,利用FID对不同碳氢化合物的等碳响应原理,即同样质量烃类物质的FID响应值近似,因而可以通过内标法对不同来源的矿物油进行准确定量,也就解决了矿物油缺乏标准参考物质的难题[20]。不过,矿物油涉及的碳数范围较广(n-C10～C50),化合物众多,无法分离,其GC-FID谱图是数以万计化合物组成的驼峰。该驼峰必须距离基线一定高度才能准确积分计算,从而满足分析检测的不确定度要求。因此,一般仪器噪音计算检出限的方法GB/T 5009.1—2003《食品卫生检验方法理化部分总则》不适用于本方法。通常,矿物油的分析方法定量限(limit of quantification,LOQ)通过经验值计算[20]。

欧盟委员会联合研究中心(European Commission’s Joint Research Centre,JRC)2019年出台的指导意见《食品和食品接触材料中矿物油测试的取样、分析和数据报告指南》中指出：矿物油的LOQ值除了受基线影响,驼峰宽度(碳数范围)的影响也较大[3]。因此,至少需要有50～100 ng矿物油进入FID才能准确定量。饮料酒的LOQ值计算方法是：取样量为20 mL,经提取、浓缩后得到体积为1 mL,注入HPLC-GC的体积为100 μL,相当于2 mL样品中的矿物油进入FID检测,因而对应的LOQ值为0.05 mg/L(以进入检测器的矿物油质量为100 ng计算)。如果需要更低的LOQ值,则需要增加取样量或浓缩倍数。

2.2.2 回收率和精密度

本实验选取白酒样品进行基质加标回收率实验,MOSH的添加量为2个水平,分别为0.05和0.50 mg/L;考虑到MOAH的含量较低,添加量为1个水平,含量为0.05 mg/L,平行测定6次后计算加标回收率和RSD。结果显示：加标回收率为87%～107%,RSD为1.9%～4.9%(表3),说明该方法的准确度满足分析检测要求。

表3 加标回收率考察(n=6)Table 3 Recoveries of spiked samples(n=6)

2.3 样品分析

应用建立的分析方法分别测定了17个市售白酒、葡萄酒和啤酒中的MOSH和MOAH的含量,并且根据JRC指南要求划分了碳数范围(碳段),其中MOSH划分为6个碳段,MOAH划分为4个碳段。结果表明(表4),尽管本文的方法定量限比文献值低[16-17],但没有在啤酒和葡萄酒中检出矿物油,却在5个白酒中检出MOSH,其中2个含有MOAH。矿物油的检出率超过了50%,说明白酒的矿物油污染严重,应当予以重视。

由于白酒比葡萄酒和啤酒更容易受到矿物油污染,结合3种饮料酒的酒精度,很容易得出乙醇含量与矿物油相关的结论。原因可能与矿物油在乙醇和水中的溶解性相关,通常,矿物油更容易溶解于乙醇中。这一点和矿物油与脂肪的相关性类似,通常脂肪含量越高,受矿物油污染的风险越大,因此,食用油一直是矿物油污染的“重灾区”[12,15]。

表4 白酒中的矿物油含量 单位：mg/L

表4中的A1和A2来自同一厂家的2个包装相同的产品,它们的MOSH含量分别为0.37 mg/L和0.17 mg/L;比较HPLC-GC谱图发现,2个样品的驼峰形状相似,碳数范围均为n-C12～C22,且均以n-C16为中心(图1),说明同一厂家的污染来源相同。由于A1和A2的酒精度分别为56%和46%,对应MOSH含量分别为0.37和0.17 mg/L,进一步说明酒精度与矿物油呈正相关。

图1 白酒样品A1和A2的HPLC-GC谱图Fig.1 HPLC-GC chromatograms of MOSH in Baijiu samples

然而,其他白酒样品的矿物油与乙醇并非完全相关,如酒精度为52%的样品A4和A7并没有检出矿物油,反而酒精度只有43%的A5检出含有MOSH(0.06 mg/L)。说明矿物油污染来源主要与生产厂家相关,规范的生产工艺可以有效避免矿物油污染。

本次调查发现2个白酒样品(A8和A9)含有MOAH,它们的HPLC-GC谱图中MOSH和MOAH的峰形和碳数范围高度对应(图2),这是矿物油污染的典型特征[20]。但是,A8和A9之间的峰形和碳数范围有差异,说明污染来源不同。

a-白酒样品A8;b-白酒样品A9图2 白酒样品A8和A9中MOSH和MOAH的HPLC-GC谱图Fig.2 HPLC-GC chromatograms of MOSH and MOAH in Baijiu samples

A8和A9来自不同生产厂家,A8为米香型白酒,其MOSH由2个驼峰组成,第1个峰的碳数以n-C17为中心,范围为n-C12～C20,含量为0.10 mg/L;第2个峰以n-C28为中心,碳数范围为n-C20～C38,含量为0.17 mg/L;与MOSH对应的MOAH也有2个驼峰,碳数范围也集中在n-C16～C35(0.1 mg/L)。A9是清香型白酒,其MOSH和MOAH均只有1个驼峰,碳数范围从n-C12到n-C40以上(以n-C28为中心),MOSH的含量为2.74 mg/L,MOAH的含量为1.24 mg/L。A8和A9的共同点在于均为金属罐包装。因此,其污染来源很可能来自金属罐,金属罐加工过程会接触到润滑剂,润滑剂通过金属包装迁移进入白酒,引起污染[22]。

不过,同样是金属罐包装的白酒A7并未检出矿物油,说明规范的工艺可以避免矿物油污染。此外,塑料瓶包装的A4也未检出矿物油,其分析谱图也没有显示出塑料迁移的聚烯烃寡聚饱和烃(polyolefin oligomeric saturated hydrocarbons,POSH)的特征峰[23]。

3 结论

本文通过优化液液萃取中正己烷-乙醇-水三相溶剂体系的比例,结合最新的HPLC-GC联用技术建立了白酒、葡萄酒和啤酒中MOSH和MOAH的高灵敏度测定方法,定量限达到0.05 mg/L。应用该方法调查了市售17个饮料酒产品中的矿物油含量。结果发现,酒精度低的啤酒和葡萄酒中均未检出污染,但白酒中有一半以上检出污染,其中2个产品含有MOAH。数据分析表明,矿物油污染与生产厂家和包装材料密切相关。