孙会刚,陈志轩,卞路遥，陈学红,周中驰,李同祥

(徐州工程学院 食品与生物工程学院，江苏 徐州 221018)

近年来，天然防腐剂因其高效、安全、广谱等特点逐渐成为食品防腐剂领域研究的热点[1]，天然植物提取物更是由于含有酚类、有机酸、类黄酮类化合物，常被用来作为亚硝酸钠功能替代品应用到食品防腐领域[2]。本文对两种徐州地区特色的食用植物进行复配后提取活性物质，并将其应用于食品防腐保鲜，显示了较好的效果。

牛蒡是菊科牛蒡属直根系二年生大型草本植物，原产于我国，为我国传统中药中的一种。牛蒡根中富含菊糖、纤维素、蛋白质、氨基酸以及钙、磷、铁等人体所需的多种营养物质和矿物质，而且其具有多种生理活性，它不仅可以清除体内垃圾，改善体循环，尤其对糖尿病、性机能减退、肥胖症、风湿等病症有明显效果[3]。已有文献报道关于牛蒡活性物质的提取、抗菌等方面的研究。牛蒡在食品方面的应用主要是牛蒡相关保健食品的开发，如牛蒡茶、牛蒡饮料、牛蒡酱等[4]；牛蒡提取物在食品防腐保鲜方面也有报道，如方海峰等研究了牛蒡乙醇提取液对蓝莓有明显的保鲜效果[5]；贺菊萍等研究发现牛蒡皮提取液对猪肉中腐败菌单增李斯特菌具有较好的抑制作用[6]；崔莉等研究证明牛蒡复合保护剂能够提高益生菌的耐受性[7]。

苔干，又名响菜、贡菜，为植物系菊科莴苣属茎用莴苣，是我国江苏邳州市和安徽涡阳县义门镇的名优特产蔬菜，迄今已有两千多年的种植历史。苔干中含有丰富的氨基酸、果胶、多糖、黄酮类、酚类物质以及各种无机盐，具有健胃、利水、清热解毒等功能，有“天然保健品”、“植物营养素”之称。目前，已有文献报道关于苔干活性成分及其抑菌方面的研究[8]，根据以上研究，可以得出苔干提取物具有良好的抑菌作用，其在食品防腐保鲜方面的应用报道较少，仅有卢臣等报道通过试验确定了苔干乙醇提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等细菌有良好的抑制作用，对馒头、圣女果、橘子、湿面条均有不同程度的防腐保鲜作用[9]。苔干在食品防腐保鲜方面的研究还需要更加全面、深入的开展。

本研究拟对苔干和牛蒡复配后活性物质提取条件进行优化，并研究其对抗菌活性的影响及其在食品方面的防腐保鲜作用。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

材料：牛蒡(burdock)：购于徐州丰县；苔干(dried moss)：购于徐州邳州。

菌株：大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes，简称单增李斯特菌)，均为实验室保存。

试剂：氯化钠、琼脂粉，天津市福晨化学试剂厂；胰蛋白胨、酵母浸出粉，上海国药集团化学试剂有限公司；马铃薯葡萄糖肉汤，上海博微生物科技有限公司；无水乙醇，上海凯沃生物技术有限公司。

1.2 仪器设备

IS-RDH2恒温恒湿振荡器 上海欣蕊自动化设备有限公司；303-1电热恒温培养箱 绍兴市银河机械设备有限公司；GS-700高速多功能粉碎机 永康市天祺盛世工贸有限公司；低温台式离心机 北京联合科力科技有限公司；KQ5200DE数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；Christ Alpha 1-2 LSC真空冷冻干燥机 德国Christ公司；RE-2000B旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 牛蒡苔干复配后活性物质的提取

1.3.1.1 牛蒡与苔干的处理

牛蒡：将新鲜牛蒡根茎洗净后切块，用2%的柠檬酸溶液浸泡10 min，于60 ℃恒温干燥箱中烘干至恒重，用高速多功能粉碎机粉碎，过40目筛，用无菌袋收集，置于4 ℃冰箱中备用。

苔干：将苔干置于去离子水中进行复水，洗净后，放入恒温干燥箱内，于60 ℃烘干至恒重，用高速多功能粉碎机粉碎，过40目筛，用无菌袋收集，置于4 ℃冰箱中备用。

1.3.1.2 提取液的制备

考虑到在食品防腐中的应用，本试验采用超声波辅助提取法[10]，用乙醇来提取牛蒡和苔干中的抑菌活性物质。准确称量4份10 g牛蒡粉与苔干粉，分别置于4个锥形瓶中，按料液比1∶10，再分别量取100 mL的80%乙醇和水加入锥形瓶中。充分混匀后，将4个锥形瓶放入超声清洗器中，于室温28 ℃下密封浸提1 h。待原料浸提完成后，将提取液进行抽滤，并将滤液于旋转蒸发仪中在45 ℃下浓缩至10 mL，得到原液(原液浓度为1 g/mL)。

1.3.2 牛蒡和苔干的复配

将牛蒡粉与苔干粉分别按6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8的比例混合，按上述提取液的制备方法进行抗菌物质的提取。

1.3.3 抑菌试验

采用牛津杯法[11]。

1.3.4 牛蒡与苔干复配提取的单因素试验

在提取过程中发现，影响牛蒡和苔干抗菌活性物质有4个主要因素，分别是提取温度、提取时间、乙醇浓度及复配比。将提取温度28 ℃、60%乙醇、料液比1∶10、牛蒡与苔干的复配比5∶5、用超声波辅助提取且提取时间60 min设定为前提条件，每个因素选取5个变量，分别是28，45，55，65，75 ℃；20，40，60，80，100 min；水、20%、40%、60%和80%乙醇；6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8进行优化。在单因素试验的基础上，选择对抑菌活性影响最大的3个水平进行正交试验进一步优化。

1.3.5 牛蒡与苔干复配提取的正交试验

为综合考虑各个因素影响的主次顺序，在单因素试验的基础上确定影响每个因素的3个水平，按正交表L9(34)安排试验，试验结果以抑菌圈直径大小来表示，试验结果需重复3次取平均值。根据极差的大小确定影响牛蒡和苔干提取工艺的主要与次要因素。

1.3.6 牛蒡与苔干提取液在食品防腐保鲜中的应用

1.3.6.1 腐烂程度

水果、蔬菜及其他种类食品在其日常的保藏过程中腐烂、发霉的现象普遍存在，因此防止食品发生或者减缓其腐败成为食品保藏运输中最令人关注的问题。本文中食品的腐烂程度主要以腐烂指数[12]为指标进行评价，具体见下式：

腐烂级别：0级为无腐烂；1级为0～1/4面积腐烂；2级为1/4～1/2面积腐烂；3级为1/2～3/4面积腐烂；4级为3/4～1面积腐烂。

1.3.6.2 提取物对馒头的防腐保鲜作用

购买新鲜馒头，均匀切成12块，分为4组，每3块为一组作为平行试验组。用1倍和0.5倍的提取液分别充分喷洒在分好的3组馒头上，以喷洒无菌水和喷洒0.5%山梨酸钾的组合作为对照组，用保鲜膜包好之后放在37 ℃培养箱内培养，观察馒头的腐败情况。

1.3.6.3 提取物对香蕉的防腐保鲜作用

从水果店购买香蕉，用去离子水洗净，分为4组，每3根为一组作为平行试验组。用1倍和0.5倍的提取液分别充分喷洒在分好的3组香蕉上，以喷洒无菌水和0.5%山梨酸钾的组合作为对照组，用保鲜膜包好之后放在37 ℃培养箱内培养，观察香蕉的腐败情况。

1.3.6.4 提取物对番茄的防腐保鲜作用

准备8个大小一致的新鲜小番茄，分为4组，每2个为一组作为平行试验组。将番茄洗净，自然晾干后，切片处理，置于培养皿中[13]。用1倍和0.5倍的提取液分别喷洒在分好的4组小番茄上，以喷洒无菌水和0.5%山梨酸钾的组合作为对照组，用保鲜膜包好之后放在37 ℃培养箱内观察番茄的腐烂情况。

2 结果与分析

2.1 苔干和牛蒡复配活性物质提取单因素优化

2.1.1 提取温度对复配提取物抑菌活性的影响

提取温度对复配提取物的抑菌活性有一定影响(见图1)，在设定的提取条件下，28～55 ℃提取物的活性逐渐升高，55～75 ℃趋于稳定，略有下降。原因可能是随着温度升高，活性物质的溶解度增加，继续升高温度可能对活性物质的稳定造成一定影响而导致活性下降，其最适提取温度为55 ℃。故正交试验选取提取温度为45，55，65 ℃ 3个水平。

图1 提取温度对复配提取物活性的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on the activity of compound extract

2.1.2 提取时间对复配提取物抑菌活性的影响

提取时间对复配提取物的抑菌活性有一定影响(见图2)，在设定的提取条件下，80 min为最优，提取时间过短，溶解不充分；时间过长，影响活性物质的稳定性，故提取物活性会下降。故正交试验选取提取时间为60，80，100 min 3个水平。

图2 提取时间对复配提取物活性的影响Fig.2 Effect of extraction time on the activity of compound extract

2.1.3 复配比对复配提取物抑菌活性的影响

复配比对复配提取物的抑菌活性有一定影响(见图3)，牛蒡与苔干复配比为4∶6时，抑菌活性最好，而牛蒡与苔干复配比为3∶7、2∶8时，抑菌活性较低，所以选择复配比为6∶4、5∶5、4∶6 3个水平进行下一步的正交试验。

图3 复配比对复配提取物活性的影响Fig.3 Effect of compound ratio on the activity of compound extract

2.1.4 乙醇浓度对复配提取物抑菌活性的影响

乙醇浓度对复配提取物的抑菌活性有较大的影响(见图4)，当乙醇浓度为40%时，复配提取物的抑菌活性最高，当乙醇浓度为95%时提取率最低，因此选取乙醇浓度为20%、40%、60% 3个水平进行正交试验优化。

图4 乙醇浓度对复配提取物活性的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on the activity of compound extract

2.2 苔干和牛蒡复配活性物质提取正交试验

由表1～表3正交试验结果可知，以对食品常见腐败菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌的抑菌活性为考察指标，均为试验7 A3B1C3D2为最佳复配物提取条件，即提取温度为65 ℃，提取时间为60 min，复配比为4∶6，乙醇浓度为40%。

表1 复配提取物对大肠杆菌抑菌活性的正交试验Table 1 Orthogonal test of antibacterial activity of compound extract against Escherichia coli

表2 复配提取物对金黄色葡萄球菌抑菌活性的正交试验Table 2 Orthogonal test of antibacterial activity of compound extract against Staphylococcus aureu

表3 复配提取物对蜡样芽孢杆菌抑菌活性的正交试验Table 3 Orthogonal test of antibacterial activity of compound extract against Bacillus cereus

2.3 抑菌试验

按照上述抑菌试验方法，对牛蒡、苔干、牛蒡苔干复配提取物优化前、牛蒡苔干复配提取物优化后进行抑菌试验，发现复配优化后提取物的抑菌活性比牛蒡、苔干单独的提取物及复配优化前的提取物抑菌活性都要好(见图5)。同时本试验也比较了牛蒡、苔干的水提取物，发现两者的乙醇提取物比水提取物的抑菌活性更好(见图6)，所以复配后选取进行乙醇提取并优化。

图5 复配比对复配提取物抑菌活性的影响Fig.5 Effect of compound ratio on antibacterial activity of compound extract

图6 优化后的提取物与牛蒡、苔干单独提取物抑菌活性比较Fig.6 Comparison of the antibacterial activity of the optimized extract and extract of burdock and dried moss alone

2.4 复配提取活性物质防腐保鲜作用

2.4.1 腐烂程度

根据上述方法考察复配提取液对鲜切番茄、香蕉、馒头腐烂指数的影响。以无菌水和0.5%山梨酸钾作为对照，试验结果显示复配提取物对3种食品均有一定的防腐作用，且对馒头的防腐效果最好，且1倍的提取液对香蕉的防腐效果比0.5倍的提取液明显更好，见表4。

表4 复配提取物对番茄、香蕉、馒头腐烂指数的影响Table 4 Effects of compound extract on decay indexes of tomato, banana and steamed bread

2.4.2 鲜切番茄保藏过程的表观评定

由图7可知，复配提取液的0.5倍、1倍以及0.5%的山梨酸钾对鲜切番茄的防腐保鲜效果均比无菌水好。无菌水喷洒过的鲜切番茄出现大面积发霉变质，0.5%山梨酸钾对鲜切番茄的保鲜效果较好，而经过提取液喷洒后的鲜切番茄仅有少面积发霉变质，有效地延迟了腐败时间。

图7 复配提取物对鲜切番茄的防腐试验Fig.7 Preservation test of compound extract on fresh-cut tomato

2.4.3 香蕉保藏过程的表观评定

由图8可知，喷洒无菌水的香蕉出现了大面积的黑色斑点，香蕉的果肉出现轻微黑色，而喷洒了1倍复配提取液的香蕉防腐状态较好，防腐效果其次是0.5%的山梨酸钾与0.5倍的提取液。

图8 复配提取物对香蕉的防腐试验Fig.8 Preservation test of compound extract on banana

2.4.4 馒头保藏过程的表观评定

对于馒头的防腐效果(见图9)，1倍复配提取液对馒头的防腐效果最佳，无明显腐败现象，其次防腐效果为山梨酸钾溶液，而无菌水的腐败情况最严重且大面积发霉。

图9 复配提取物对馒头的防腐试验Fig.9 Preservation test of compound extract on steamed bread

3 结语

植物源天然防腐剂应用于食品防腐保鲜的研究很多，如洪军等研究发现，石榴皮提取物对5种食源性致病菌具有很好的抑菌作用，并可将冷却鸡肉的保鲜延长至10 d左右[14]；闫佳佳等研究了汉麻叶黄酮成分及其抑菌活性，发现该植物成分对3种食源性致病菌的抑菌效果较为明显[15]。天然防腐剂因其安全性和抑菌广谱性，在调味品防腐保鲜方面也具有较大的应用潜力，如李惠等研究发现微生物源天然防腐保鲜剂Nisin显著抑制番茄酱菌落总数的增加[16]；郭俊华制备的复合调味品姜酱使用了植物源的有效成分R-多糖和植酸，取得了较好的防腐保鲜效果[17]；孙莹用丁香和桂皮作为复配防腐剂将低盐酱加工成具有良好防腐保鲜效果的调味低盐酱[18]。本研究用到的材料牛蒡和苔干提取物应用于食品防腐保鲜方面的研究较少，对牛蒡和苔干两种植物材料进行复配后提取活性物质也属首次，对于植物源天然防腐剂的开发具有一定的借鉴价值。

牛蒡和苔干都能产生多种活性物质，本文采用复配的方法提取其中的活性物质，通过单因素和正交试验优化其活性物质提取工艺，获得了最优的提取方案。通过抑菌试验证明，复配后其抑菌活性比牛蒡、苔干单独提取物的抑菌活性明显增强。用无菌水和0.5%山梨酸钾作为对照验证牛蒡、苔干复配提取物在食品中的防腐作用，结果显示其具有较好的防腐保鲜效果。且牛蒡、苔干又含有大量的活性成分，用其复配物作为防腐保鲜剂添加到食品中又具有一定的保健功能，对于新型功能性食品的开发提供了一个新的思路。