王国红，李丹林，朱柏润，马怀良，穆 燕，律凤霞，姜 明

（牡丹江师范学院生命科学与技术学院，黑龙江 牡丹江 157012）

黑木耳（Auricularia auricula）又称木耳、黑菜、树鸡等，属真菌界担子菌门木耳目木耳科木耳属，是1种药食两用的大型真菌。黑木耳栽培区域分布较广，在东北地区、贵州、云南、福建等地均有栽培［1］，中国黑木耳产量占全世界96%以上［2］。黑木耳营养价值高，富含蛋白质、氨基酸、多糖等活性物质，具有抗氧化、降血糖、抗肿瘤、抑菌、预防动脉粥样硬化等作用［3-5］。黑木耳子实体中的黑色素是黑木耳特有的功能性物质之一，在抗氧化、抗病毒、抗辐射、免疫调节和DNA保护方面发挥着重要生理功能［6，7］，可作为食品添加剂［8］、生物农药的保护剂［9］、防晒霜和染发剂［10］。近年来，黑木耳大棚吊袋栽培模式日益增多，产量也得到了提升，但是子实体黑色素少、颜色偏淡、商品性能较差，制约了产业的发展。因此，在分子水平上研究黑木耳黑色素的合成途径、表达、调控等机制具有重要意义。

多巴色素异构酶（Dopachrome tautomerase，DCT）是酪氨酸酶合成家族成员之一，也是黑色素合成途径中的重要限速酶。DCT有1个类似表皮生长因子（Epidermal growth factor，EGF）的结构域和2个富含组氨酸的金属结合位点［11］。在黑色素合成的第2阶段，DCT通过调节多巴色素向5，6-二羟基吲哚或5，6-二羟基吲哚羧酸的转化形成真黑色素，当DCT缺乏或不足时，将影响黑色素的代谢［12］。

尽管黑木耳全基因组测序已完成，还有相当多的基因没有明确的功能注释信息。目前，关于黑木耳多巴色素异构酶基因的研究较少，本研究克隆了多巴色素异构酶基因，并通过生物信息学对多巴色素异构酶基因的理化性质、保守结构域、二级结构、信号肽、跨膜结构等方面进行了预测分析，旨在为进一步探究多巴色素异构酶基因功能和黑色素代谢途径提供参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料

黑木耳菌Mn150、克隆载体pEGM-T试剂盒，购自Promega Corporation公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞由本实验室制备；DNA提取试剂盒和普通DNA产物纯化回收试剂盒，购自天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化和菌丝培养 将黑木耳菌Mn150接种在PDA固体培养基上，28℃恒温培养7 d后，挑取新鲜的菌丝再次接种到PDA液体培养基中，28℃165 r/min条件下培养7 d。

1.2.2 多巴色素异构酶基因的克隆 ①引物设计。通过Primer Premier5设计DCT基因的特异性引物，引物为AuTau-F（5′—3′）：ATGCCAACTCTCGTCCTCAC；AuTau-R（5′—3′）：TTACTTCCCAAAGATTGTGG。②黑木耳菌DNA的提取及PCR扩增。将菌液过滤，收集菌丝，吸去多余的水分，采用普通DNA提取试剂盒提取DNA，通过PCR仪进行基因扩增。PCR反应体系为20μL：ddH2O 6μL，2×Taq plus MasterMix 10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，DNA模板2μL。PCR反应程序为：94℃5 min，94℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，35次循环，72℃20 min。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，再用DNA纯化回收试剂盒回收PCR产物。③连接反应与遗传转化。将纯化的PCR产物与载体连接，室温1 h后再转入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。10μL连接液加入到100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30 min，42℃热激90 s，加入500μL LB液体培养基，37℃220 r/min振荡培养45 min，再加入12μL IPTG，混匀。取100μL涂在含Amp、X-gal的LB固体平板培养基上，37℃倒置培养12～16 h。④阳性克隆的筛选和检测。在LB平板上挑取10个白色单菌落，接种至含Amp的LB液体培养基中，37℃220 r/min振荡培养5 h。以菌液为模板进行PCR扩增验证，PCR反应体系为20μL：ddH2O 7μL，2×Taq plus MasterMix 10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，菌液模板1μL，PCR反应程序为：95℃3 min，94℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，30次循环，72℃5 min。阳性菌液送哈尔滨擎科生物公司测序。

1.2.3 多巴色素异构酶基因的生物信息学分析 利用在线软件ExPASy Translate将测序验证后的多巴色素异构酶基因的核酸序列翻译为氨基酸序列，然后进行生物信息学分析。运用在线软件ExPASy protparm tool分析蛋白质的理化性质；ExPASy ProtScale分析亲水性与疏水性；运用NCBI Conserved Domains search分析保守区和蛋白家族；利用在线软件Signal P4.0 Server预测信号肽；运用在线软件TMHMM Server V2.0进行跨膜区分析；利用SOPMA在线软件预测分析蛋白质二级结构。

2 结果与分析

2.1 黑木耳菌Mn150液体培养

黑木耳菌Mn150接种在PDA液体培养基中，振荡培养7 d后，产生大量菌丝球（图1），过滤收集菌球，提取DNA。

图1 黑木耳菌株Mn150液体培养

2.2 黑木耳菌丝DNA的提取

通过PDA液体培养，收集菌丝，利用普通DNA提取试剂盒提取黑木耳菌丝DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示条带整齐、清晰，没有拖尾和弥散现象（图2）。这说明提取的DNA质量较好，基本没有降解，可用于PCR扩增。

图2 黑木耳DNA电泳结果

2.3 多巴色素异构酶基因的克隆

以提取的DNA为模板，AuTau-F和AuTau-R为引物进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，获得与目的条带一致的特异性条带，大小为625 bp（图3）。PCR产物经普通DNA产物纯化试剂盒回收后与pGEM-T Easy Vector载体连接，再转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单菌落进行PCR验证，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，获得与目的条带一致的特异性条带，结果如图4所示。将阳性菌液送哈尔滨擎科生物公司测序，获得序列长度为625 bp。测序结果进行序列比对，去除内含子，获得大小为355 bp的外显子序列，之后进行生物信息学分析。

图3 PCR扩增产物

图4 菌液PCR验证

2.4 多巴色素异构酶基因的生物信息学分析

2.4.1 DCT理化性质分析 运用在线软件ExPASy protparm tool分析蛋白质的理化性质，结果显示，DCT蛋白由112个氨基酸残基组成，分子式为C584H921N181O153S4，原子总数为1 843个，分子质量为13.05 kDa，带正电荷的氨基酸残基有19个，带负电荷的氨基酸残基有10个，等电点为10.35，不稳定系数为47.63，脂肪系数是80.80，总平均亲水系数为-0.577，为亲水蛋白。

2.4.2 DCT亲水性与疏水性分析 为后期蛋白纯化、表达研究提供参考，利用ExPASy ProtScale软件对DCT蛋白的亲、疏水性进行了分析［13］，结果如图5所示。由图5可知，该蛋白第96位氨基酸处疏水性最强，得分为1.222；第65位氨基酸亲水性最强，得分为-2.789；大部分氨基酸得分在0以下，说明DCT蛋白是亲水性蛋白。

图5 DCT蛋白亲、疏水性预测

2.4.3 保守区和蛋白家族预测 通过对DCT蛋白的保守结构域和蛋白家族预测（图6），发现该蛋白的氨基酸序列含有1个4-Oxalocrotonate Tautomerase Superfamily保守结构域，该结构域是互变异构酶超家族中的成员，说明DCT属于4-Oxalocrotonate Tautomerase Superfamily基因家族。

图6 DCT蛋白保守区和蛋白家族预测

2.4.4 信号肽预测 信号肽是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链，位于分泌蛋白的N端，由16～26个氨基酸残基构成，包括疏水核心区、信号肽N末端和C末端3个区，各个区发挥不同的功能［14］。通过对DCT蛋白信号肽预测发现，DCT蛋白没有信号肽（图7）。

图7 DCT蛋白信号肽预测

2.4.5 跨膜区预测 膜蛋白包括胞外区、跨膜区和胞内区。跨膜区的主要作用是把膜蛋白固定在细胞膜上。经TMHMM Server V2.0在线软件进行跨膜区预测分析，结果表明DCT蛋白不含跨膜结构，说明该蛋白不是跨膜蛋白（图8）。

图8 DCT蛋白跨膜区预测

2.4.6 二级结构预测 蛋白质二级结构指多肽链盘旋或折叠形成特定的空间结构，包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲。利用SOPMA在线软件对DCT蛋白二级结构进行预测，结果表明该蛋白由20.54%的α-螺旋、5.36%的β-折叠、54.46%的无规卷曲和19.64%延伸链组成（图9）。

图9 DCT蛋白的二级结构

3 小结与讨论

酪氨酸酶家族相关基因包括酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1、多巴色素异构酶，这3个成员在黑色素合成过程中具有不同的作用，共同决定黑色素的生物合成［15，16］。在黑色素合成途径中，DCT是酪氨酸酶催化位点的下游的1个重要的调节酶，对黑色素的生物合成具有重要作用。研究黑木耳DCT对黑色素的合成具有较高的价值，通过对多巴色素异构酶的调控，可以控制黑色素的产量，发挥黑木耳黑色素在抗氧化、抗病毒以及提高免疫力等方面的生物活性。除此之外，也可以拓展黑木耳黑色素在食品方面的应用。目前，生物信息学分析主要针对目的基因的理化性质分析、亲疏水性分析、结构域预测、基因家族和二级、三级结构等方面［17］。生物信息学的发展为功能基因组学提供了有利的研究手段，通过生物信息学分析方法对克隆基因进行功能预测能达到较好的效果。

本研究以黑木耳DNA为模板，克隆DCT基因，进行测序，测序结果进行序列比对，去除内含子，获得了大小为355 bp的外显子序列。通过对DCT基因的生物信息学分析发现，DCT基因由112个氨基酸残基组成，分子质量为13.05 kDa，等电点为10.35，为亲水性蛋白。该蛋白的氨基酸序列含有1个4-Oxalocrotonate Tautomerase Superfamily保守结构域，DCT蛋白没有信号肽，不含跨膜结构。该蛋白由20.54%的α-螺旋、5.36%的β-折叠、54.46%的无规卷曲和19.64%延伸链组成。该结果可为DCT基因相关性质和功能研究提供参考。