杜静 贾冬雪 王书华

全球疾病负担统计表明，我国脑卒中发病率高达39.9%，全球排名第一[1]。急性缺血性脑卒中目前最有效治疗方法之一为血管介入再通，而部分大血管开通后再灌注导致神经功能进一步恶化[2]，因此探索寻找保护缺血再灌注脑组织损伤的相关药物成为目前临床科研工作者一个研究热点。荭草苷是中药金莲花中的主要有效活性成分之一，课题组已成功从金莲花中提取出荭草苷，经证实其纯度达98.8%[3]，兔体内药代动力学研究表明荭草苷在肾、肝、脑等组织中均有分布，分布与消除较快，不易产生蓄积中毒[4]。团队既往研究表明荭草苷调控JNK/ERK通路抑制自噬过度激活对脑缺血再灌注大鼠脑组织的保护[5]，而PI3K/Akt 信号通路是脑缺血再灌注损伤及自噬调控的重要通路，本实验进一步探讨荭草苷是否通过激活PI3K/Akt信号通路抑制线粒体自噬过度激活从而保护缺血再灌注大鼠脑组织，为荭草苷用于临床研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：SPF级健康雄性SD大鼠，购自北京斯贝福生物科技有限公司，体重250～280 g，许可证号SCXK (京) 2019-0010，购进实验室后于温度(24±2)℃，湿度(50±2)%的条件下按照自然节律饲养，正常饮食标准适应性喂养1周后，选取体重和状态合格的大鼠进行后续实验。

1.1.2 药品与试剂：荭草苷(自制，纯度98.8%)；LY294002(70920)，购自Cayman公司；自噬微管相关蛋白轻链3(LC3)抗体(PM036)，日本MBL公司生产；Bcl-2/E1B-19 K相互作用蛋白3(BNIP3)抗体(A19593)，磷酸化Akt抗体(AP0140)，Akt抗体(A11016)，均购自ABclonal公司。

1.1.3 仪器：电泳仪，美国Bio-Rad 公司；FM0530多色荧光和化学发光成像系统，ProteinSimple公司；Sigma 3K30型超速冷冻离心机，德国Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 药物配制

1.2.1.1 荭草苷溶液：荭草苷用N,N-二甲基甲酰胺(dimethylsulfoxide,DMF)溶解，加入吐温-80助溶，最后加入0.9%氯化钠溶液稀释(DMF∶吐温-80∶0.9%氯化钠溶液=1∶1∶20)，配制成6.48 μmol/kg溶液。

1.2.1.2 LY294002溶液：将LY294002粉末溶解于DMSO和吐温-80(DMSO∶吐温-80=1∶1)中，加入0.9%氯化钠溶液稀释，配制成2.60 mg/ml的LY294002溶液。

1.2.2 大鼠脑缺血再灌注模型制备：采用改良线栓法制备MCAO模型,大鼠禁食不禁水12 h后腹腔注射7%水合氯醛(350 mg/kg)深度麻醉，仰卧固定于手术台上，于颈部正中位置用直剪做纵向切口，钝性分离组织，暴露右侧颈总动脉，小心分离颈总动脉和迷走神经，并向上分离出颈内动脉和颈外动脉，结扎颈总动脉近心端和颈外动脉，夹闭颈内动脉，在颈总动脉距分叉4 mm处剪1小孔，将栓线包有硅胶一端小心从开口处插入，沿颈内动脉缓慢推进18～20 mm，遇到阻力即停，表明栓线硅胶膨大处已阻塞大脑中动脉，将栓线固定好。缺血2 h后，小心缓慢地拔出栓线(拔线时为避免挣扎对血管造成损伤大鼠一直处于麻醉状态)，制备MCAO模型完毕。假手术组大鼠只分离血管，不插入栓线。

1.2.3 分组与给药：将造模成功的大鼠随机分为I/R组、荭草苷组、荭草苷+LY294002组、LY294002组，假手术组作对照组，每组8只。荭草苷给药组分别于术后1 h和12 h腹腔注射6.48 μmol/kg荭草苷溶液2次，荭草苷+LY294002组和LY294002组分别于术前24 h和0.5 h给予2.60 mg/ml LY294002溶液2次，假手术组和I/R组给予同等剂量的溶剂+ 0.9%氯化钠混合溶液。

1.2.4 神经功能缺损评分：再灌注24 h后，按照Zea Longa建立的评分法对各组大鼠进行神经功能损伤评分，通过观察双侧肢体肌力大小、大鼠肢体动作的协调性以及探索能力，对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能损伤程度做直观评估，分数越高，神经功能损伤越严重。0分：大鼠肢体运动正常，无明显行为学改变；1分：大鼠左前爪蜷曲，不能完全舒展；2分：大鼠左侧抗侧推能力明显减弱，肩内收，走路时向左侧转圈；3分：行走时向左侧倾斜摇摆不定；4分：意识模糊，不能自发行走。

1.2.5 大鼠脑梗死体积测定：再灌注24 h后，5组大鼠深度麻醉取脑，预冷0.9%氯化钠溶液冲洗干净，-20℃冷冻20 min，对脑组织等距冠状切片，每片厚度约2 mm，放入配好的2%TTC染液中于37℃温箱中染色15 min，每5分钟翻动1次以保证脑组织均匀染色，将脑片放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，其中红色部分为正常组织，白色部分为梗死组织。滤纸吸干水分拍照，用Image J软件分析图片，为排除脑水肿对脑梗死体积测定的影响，采用校正后的计算公式计算脑梗死体积百分比：脑梗死体积百分比=(缺血对侧正常脑组织体积-缺血侧正常脑组织体积)/缺血对侧正常脑组织体积×100%。

1.2.6 半球肿胀的测定：针对TTC染色图片，应用Image J分析软件分析计算各组大鼠的半球肿胀。具体计算公式如下：脑半球肿胀百分比=(缺血侧体积-缺血对侧体积)/缺血对侧体积×100%。

1.2.7 大鼠脑组织线粒体蛋白和胞浆蛋白提取：从-80℃冰箱取出冻存脑组织约100 mg，精准称重后剪碎，按比例加入含有1% PMSF和1%磷酸酶抑制剂的线粒体分离液A(组织：线粒体分离液A=1∶10)，放入玻璃匀浆器中制备成匀浆液，于4℃，600 g条件下离心5 min，小心转移上清液至另一离心管，于4 ℃，11 000 g条件下离心10 min，沉淀即为线粒体。此步骤收集上清液于4℃，12 000 g离心10 min，上清液即为去除线粒体的细胞浆蛋白。在线粒体沉淀中加入含有1% PMSF的线粒体裂解液(组织：裂解液=1∶2)，涡旋混匀，冰浴上反应20 min，每5分钟涡旋混匀一次保证线粒体可充分裂解，裂解液于12 000 r，4℃条件下离心10 min，上清即为所需的线粒体蛋白。

1.2.8 Western blot检测大鼠脑组织线粒体中BNIP3、LC3蛋白和胞浆中Akt、p-Akt蛋白的表达：BCA法测定蛋白浓度后金属浴变性制备上样样品，线粒体蛋白以COX Ⅳ为内参，胞浆蛋白以β-actin为内参，通过计算目标蛋白和内参的比值反应各组蛋白的表达水平。

2 结果

2.1 荭草苷对大鼠神经功能损伤评分的影响 假手术组大鼠肢体运动无明显改变，评分为0分；与假手术组比较，I/R组大鼠出现明显肢体运动障碍，神经功能评分显著升高(P<0.01)；与I/R组比较，荭草苷治疗后大鼠神经功能明显改善，评分明显降低(P<0.01)；与荭草苷组比较，荭草苷+LY294002处理组大鼠神经功能损伤评分升高(P<0.05)。见表1。

表1 5组大鼠神经功能缺损评分、脑梗死体积及半球肿胀程度

2.2 荭草苷对大鼠脑梗死体积的影响 与假手术组比较，I/R组大鼠脑梗死体积显著增加(P<0.01)；与I/R组比较，荭草苷处理组大鼠脑梗死体积明显降低(P<0.01)；与荭草苷组比较，荭草苷+LY294002处理组大鼠脑梗死体积显著增加(P<0.05)。见表1，图1。

图1 荭草苷和 LY294002对大鼠脑梗死体积的影响

2.3 荭草苷对大鼠脑半球肿胀的影响 与假手术组比较，I/R组大鼠脑组织半球肿胀百分比明显增加(P<0.01)；与I/R组比较，荭草苷给药组大鼠脑半球肿胀百分比明显降低(P<0.01)；与荭草苷组比较，荭草苷+LY294002处理组大鼠脑半球肿胀百分比明显增加(P<0.05)。见表1，图1。

2.4 荭草苷对大鼠脑组织线粒体中LC3、BNIP3蛋白表达的影响 Western blot结果显示，与假手术组比较，I/R组大鼠脑组织线粒体中LC3和BNIP3蛋白相对表达量显著增加(P<0.01)；与I/R组比较，荭草苷处理组大鼠脑组织线粒体中LC3和BNIP3蛋白的表达显著降低(P<0.05)；抑制剂LY294002处理组大鼠脑组织线粒体中LC3和BNIP3蛋白的表达显著增加(P<0.05)；与荭草苷组比较，荭草苷+LY294002能明显增加大鼠脑组织线粒体中LC3和BNIP3蛋白的相对表达(P<0.05)。见表2，图2。

表2 5组大鼠脑组织粒体中 LC3、BNIP3 蛋白及胞浆中 p-Akt 蛋白表达水平

图2 荭草苷和 LY294002对大鼠线粒体自噬的影响

2.5 荭草苷对大鼠脑组织胞浆中p-Akt蛋白表达的影响 以β-actin为内参，通过p-Akt/Akt的比值来反映p-Akt的表达情况。Western blot结果显示，I/R组大鼠脑组织胞浆中p-Akt的相对表达量远低于假手术组(P<0.01)；与I/R组比较，给予荭草苷治疗后p-Akt相对表达量显著升高(P<0.01)，LY294002处理组p-Akt蛋白的相对表达水平降低(P<0.05)；与荭草苷组比较，荭草苷+LY294002能够明显降低p-Akt蛋白的相对表达水平(P<0.05)。见表2，图3。

图3 荭草苷对大鼠PI3K/Akt信号通路的影响

3 讨论

脑缺血再灌注损伤是目前临床治疗缺血性脑卒中过程中发生率很高的一种并发症[6,7]。脑缺血再灌注损伤的主要病理表现是出现脑梗死灶，脑梗死主要是血液供应不足导致缺血核心区发生不可逆坏死，以及核心区周围的短时间血液供应不足导致的缺血半暗带组织，此区域的组织若不能及时救治最终也会发展成不可逆坏死组织[8]。TTC可与正常脑组织中的脱氢酶反应呈现红色，梗死组织因脱氢酶失活无法与TTC结合而呈现白色，通常采用TTC染色法测定脑梗死体积。本研究结果显示荭草苷能明显降低大鼠脑梗死体积和神经功能损伤评分以及半球肿胀百分比，说明荭草苷可有效减轻脑缺血再灌注大鼠脑组织损伤，与王晓茹等[9]的研究结果一致。

线粒体自噬是机体应对外界刺激的重要防御机制之一，通过有效清除受损的线粒体从而保证细胞内环境稳定。但也有研究发现线粒体自噬过度激活会破坏细胞内线粒体稳态平衡，诱导细胞自噬性死亡，加重脑组织损伤[10]。PI3K/Akt信号通路调控线粒体自噬：PI3K通过磷脂将损伤信号转化为细胞内信息，进而刺激Akt磷酸化调控下游mTOR通路，抑制自噬过度激活[11]。LC3存在于自噬体和溶酶体膜上，自噬激活的标志为LC3-Ⅰ转为LC3-Ⅱ。BNIP3是存在于线粒体外膜的一种蛋白，其包含的LIR结构域与LC3相互作用，诱导线粒体自噬发生[12]。因此常用LC3、BNIP3蛋白水平高低来反应线粒体自噬水平。研究结果显示脑缺血再灌注大鼠脑组织中p-Akt的相对表达量较假手术组降低，荭草苷处理后p-Akt蛋白的相对表达水平明显升高，LC3和BNIP3蛋白的相对表达水平明显降低，表明荭草苷可激活大鼠脑组织中PI3K/Akt信号通路以及抑制线粒体自噬过度激活。与荭草苷组比较，提前给予LY294002干预能明显降低大鼠p-Akt蛋白的相对表达量，而LC3和BNIP3蛋白的相对表达水平明显升高，荭草苷对大鼠的脑保护作用也明显减弱，说明荭草苷可能是通过激活PI3K/Akt信号通路抑制线粒体自噬过度激活对脑缺血再灌注大鼠发挥神经保护作用。Yan等[13]研究也证实激活神经元中PI3K/Akt信号通路可抑制脑缺血诱导的神经元自噬。

综上所述，激活PI3K/Akt信号通路来抑制大鼠脑组织线粒体自噬过度激活可能是荭草苷发挥脑保护作用的另一个作用机制。