张科 成翠娥 陆志平 肖龙 王斌

胃癌(gastric cancer，GC)是世界范围内最常见的消化道恶性肿瘤之一，且在恶性肿瘤中其致死率排名第二[1]。随着近年来基础及临床研究的不断进步，在诊治GC方面亦取得了很大进步[2]。相关报道称，TGM2与多种肿瘤的发生及发展有密切联系[3]。许多研究发现，NEAT1在恶性肿瘤中表达异常，如神经胶质瘤[4]、乳腺癌[5]等，其在肿瘤的发生、转移及预后都有参与。miRNA为小分子非编码RNA，可调控大约30%的人类基因表达，有相关报道发现，miRNA-17-5p在肿瘤的发生、发展中有重要作用[6]。但笔者发现关于TGM2、NEAT1、miRNA-17-5p在GC组织中的表达及与疾病演进的相关性尚不明确。鉴于此，本文通过检测GC组织、正常胃黏膜组织中TGM2、NEAT1、miRNA-17-5p表达水平，分析其与疾病演进的相关性。报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本文选取2018年12月至2020年11月我院病理科保存的GC组织标本74例为研究组，其中包括男42例，女32例；年龄43～78岁，病程1～4年。另选取同一时间段在我院病理科保存的正常胃黏膜(距离癌组织>5 cm)74例为对照组，男45例，女29例；年龄44～80岁，病程0.5～4年。2组研究对象一般资料的比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。

表1 2组患者一般资料比较 n=74

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：研究组符合中国专家共识意见中关于早期GC的筛查标准[7]；均经组织病理检查确诊原发性GC的患者；研究组患者均为初诊，且诊断之前未接受有关肿瘤的治疗；近期未服用如H2受体拮抗剂、抗生素等影响研究结果药物的患者；本文研究对象及其家属均知情，签署知情同意书，经过我院伦理委员会批准。

1.2.2 排除标准：伴随其他肠道疾病的患者；60 d内有胃或十二指肠手术史的患者；伴随肝肾功能异常的患者；伴随严重心脑血管疾病、精神疾病、风湿性疾病的患者；伴随肝、肾、肺等严重脏器疾病的患者；伴随全身免疫性疾病的患者。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化:使用EnVision法检测GC组织、正常胃黏膜组织中TGM2、NEAT1的表达水平：①多聚甲醛(雷根生物科技有限公司)固定GC组织、正常胃黏膜组织，常规石蜡切片后进行烤片，使用二苯甲、乙醇进行脱蜡至水，PBS清洗3次，3 min/次。②于微波盒中加入柠檬酸盐缓冲液，加热至沸腾后将GC组织切片置与耐热塑料切片架上，PBS清洗3次，3 min/次。③0.3% H2O2加入切片15 min，阻断内源性过氧化物酶，PBS清洗3次，5 min/次。④加入50 μl鼠抗人CK，37℃作用60 min，50 μl鼠抗人C-erbB-2，37℃作用60 min，PBS清洗3次，5 min/次。于鼠抗人CK、鼠抗人C-erbB-2加入HRPanti-Mouse或Pabbit，37℃作用30 min，PBS清洗3次，5 min/次。⑤加入DAB显色，于显微镜下观察，纯净水冲洗6 min，苏木素复染，对其进行分化、冲洗、蓝化，梯度乙醇脱水，随后进行风干。⑥使用对应的免疫组化试剂盒(上海恒远生物科技有限公司)检测TGM2、NEAT1的表达水平。

1.3.2 miRNA-17-5p的检测:采用荧光定量PCR检测miRNA-17-5p表达水平，用Trizol的方法，提取所收集的细胞内总RNA，在逆转录酶的作用下合成cDNA。使用荧光定量PCR仪(济南来宝医疗器械有限公司)检测、miRNA-17-5p基因及内参GAPDH mRNA表达，检测试验共重复3次，采用软件Relative Quantification Study定量分析。

1.3.3 病理学观察:①将采集到的标本经乙醇梯度脱蜡至水，随后放入Harris苏木素染4～10 min，用纯净水清洗。②迅速用1%的盐酸乙醇进行分色，置于纯净水10～20 min。③放入伊红染液中染色3 min。④常规脱水后封片，于显微镜下进行观察。

1.3.4 TGM2、NEAT1、miRNA-17-5p阳性判定方法:采用半定量法(染色阳性细胞比例与染色强度等级之乘积)：在显微镜下随机选取10个高倍视野(×400)的切片，选取的每张切片细胞数量≥100个，0级为阳性细胞<10，1级为10%～25%，2级为26%～50%，3级为51%～75%，4级为76%～100%；根据染色程度：0级为无色，1级为淡黄色，2级为棕黄色，3级为棕褐色，按照等级乘积，阳性为≥6。

1.3.5 PGⅠ、PGⅡ的检测:抽取患者次日清晨空腹静脉血4 ml，置于转速为3 000 r/min离心机中进行10 min的离心处理。分离上血清，并将血清标本置于-80℃的环境中进行保存。采用酶联免疫吸附法检测PGⅠ、PGⅡ水平[8]。

2 结果

2.1 TGM2、NEAT1免疫组化染色 与对照组比较，研究组TGM2、NEAT1的免疫组化染色程度高，着色更深，且着色表达多呈灶状分布。见图1。

2.2 TGM2、NEAT1、miRNA-17-5p阳性表达比较 与对照组比较，研究组TGM2、NEAT1阳性表达率较高，miRNA-17-5p阳性表达率较低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 TGM2、NEAT1、miRNA-17-5p阳性表达比较 n=74,例(%)

2.3 TGM2、NEAT1、miRNA-17-5p阳性表达与GC患者的病理学参数比较 在分化程度、肿瘤大小、细胞学分型中TGM2、NEAT1、miRNA-17-5p阳性表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)。与无淋巴转移比较，有淋巴转移患者TGM2、NEAT1阳性表达率较高，miRNA-17-5p阳性表达率较低；与临床Ⅲ～Ⅳ期比较，Ⅰ～Ⅱ期患者TGM2、NEAT1阳性表达率较高，miRNA-17-5p阳性表达率较低；与黏膜下层比较，TGM2、NEAT1阳性表达率较高，miRNA-17-5p阳性表达率较低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 TGM2、NEAT1、miRNA-17-5p阳性表达与GC患者的病理学参数比较 n=74,例(%)

2.4 GC组织的Logistic回归分析 以发生GC为因变量(0=否，1=是)，TGM2、NEAT1、miRNA-17-5pR、PGⅠ、PGⅡ为自变量，建立Logistic回归模型，并校正年龄、性别等混杂因素影响，最终TGM2、NEAT1、miRNA-17-5pR、PGⅠ、PGⅡ是发生GC的危险因素。见表4。

2.5 TGM2、NEAT1、miRNA-17-5pR表达水平对发生GC的预测价值 ROC分析TGM2、NEAT1、miRNA-17-5pR表达水平预测发生GC的曲线下面积(area under the curve，AUC)分别为0.662(95%CI：0.575～0.748，P=0.000)、0.716(95%CI：0.635～0.797，P=0.000)、0.754(95%CI：0.677～0.829，P=0.000)。见表5，图2。

表4 患者发生GC的Logistic回归分析

表5 TGM2、NEAT1、miRNA-17-5p表达水平诊断发生GC的效能分析 %

图2 TGM2、NEAT1、miRNA-17-5p表达水平诊断发生GC的ROC图

3 讨论

近年来虽然在治疗GC方面有所进展，但是其死亡率仍然居高不下。有相关调查显示，在全世界范围内，GC的发病率在10～150万，在我国，其每年确诊人数在40万左右，每年死亡26万左右，其中重要的原因在于早期并没有明显的诊断手段[9,10]。因GC在早期症状大多比较隐秘，且并没有典型的症状，因此，在早期很难确诊GC，而当患者就诊时，大多处于癌症晚期，在体内已经有局部浸润和远处转移的出现，这时已经错过最佳的治疗时机[11,12]。本研究通过多因素Logistic回归分析，TGM2、NEAT1、miRNA-17-5pR表达水平均与发生GC独立相关，提示TGM2、NEAT1、miRNA-17-5pR表达水平可以作为临床预测GC的指标。

TGM2是转谷胺酶家族成员之一，由687个氨基酸残基组成，其分子量为78 kD。越来越多的研究表明，TGM2表达与多种恶性肿瘤细胞增殖及迁移密切相关，其在不同的细胞中具有不同的生物学功能[13]。相关文章报道，TGM2表达后可通过激活FAK酪胺肌酸酶活化抗凋亡信号通路PI3/AKT等，达到促进肿瘤细胞增殖的作用[14]。更有学者发现，TGM2可通过激活NF-kB通路诱导Bcl-xL与BFLI抗凋亡蛋白的表达，促使肿瘤细胞增殖[15]。周湘华等[16]的研究中表明，GC细胞中TGM2表达降低时细胞增殖能力也随之降低，在细胞增殖中TGM2可能存在促进作用。其机制可能为：TGM2高表达后，细胞生长加速，其依赖性生长能力增加、克隆数目增多，通过影响细胞的凋亡和周期促进细胞生长增殖。本文研究中，GC组织中TGM2阳性表达率高表达，与淋巴转移、临床分期、病灶深度显著相关，提示TGM2表达异常可能参与GC患者发病的过程。Logistic回归分析示TGM2表达水平增高增加1.138倍发生GC风险，ROC分析显示TGM2预测发生GC的AUC达0.662，灵敏度和特异度分别为75.52%、80.36%，提示TGM2可用于评估GC的发生。

NEAT1位于细胞核内，参与构成核旁斑的核心结构及调节众多基因转录。NEAT1是一种多聚腺苷酸化、未拼接及受限制的非编码转录本，其为RNA聚合酶2转录而来，被称为多发性内分泌瘤病。与正常组织比较，NEAT1在一些肿瘤组织及细胞系中表达升高，表明NEAT1高表达预后较差。相关研究表明，在卵巢癌组织中NEAT1呈高表达，是诊断卵巢癌的标志物，且其表达水平随着卵巢癌组织的大小以及肿瘤的分期的增加而升高[17]。喻大军等[18]研究中显示，GC中NEAT1表达水平升高，且在沉默NEAT1后，GC细胞的增殖和侵袭的能力降低。有相关研究表明，NEAT1可抑制GC细胞增殖与克隆形成，其机制可能与下调p-Akt、bcl-2极上调bax有关[19]。本文研究表明，在GC组织中NEAT1阳性表达率高表达，淋巴转移、临床分期、病灶深度与其有明显的相关性，说明NEAT1与GC的发生及发展密切相关。本研究ROC分析显示NEAT1预测发生GC的AUC达0.716，提示NEAT1是GC的警示指标。

miRNA在生物体内广泛存在，在肿瘤的发生发展、细胞的分化、增殖及凋亡中发挥着重要作用。miRNA-17-5p属于miR-17家族，在血液系统恶性肿瘤、生物体发育及实体瘤的发生中具有重要作用。相关报道称，miRNA-17-5p参与前列腺癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、GC等的发生[20]，可诱导周期阻滞及抑制肿瘤细胞增殖、侵袭转移。在GC中，miRNA-17-5p可通过抑制细胞凋亡、促进细胞周期进程达到发挥癌基因的作用[21]。当miRNA-17-5P>6.2 μmol/L时预测GC的灵敏度80.60%，特异度74.63%。本文研究显示，在GC组织中miRNA-17-5p呈低表达，与GC患者的淋巴转移、临床分期、病灶深度紧密相关，说明miRNA-17-5p有望成为GC的预后、病情及早期诊断标志物。

综上所述，GC患者组织在淋巴转移、Ⅰ～Ⅱ期、黏膜层TGM2、NEAT1阳性表达较高，miRNA-17-5p阳性表达较低，提示TGM2、NEAT1、miRNA-17-5p阳性表达与GC的病情严重程度密切相关，可能参与GC患者病情发生及发展过程，为研究GC发病机制及患者预后提供参考。