赵瑞华， 贺晓龙

(1. 延安大学 生命科学学院，陕西 延安 716000；2. 延安大学 陕西省红枣重点实验室，陕西 延安 716000)

羊肚菌(Morchella)又常称为羊雀菌、羊肚菜或草笠竹等，菌盖表面凹凸形成蜂窝状似羊肚。其子实体富含优质蛋白、矿物质和维生素等，风味独特、口感脆嫩，从古至今都是餐桌上的珍馐佳肴，同时具备抗氧化、抗病毒、提高免疫力和抑制肿瘤细胞等多种生理功能，是国内外极珍贵的食药用真菌，应用前景广阔[1-2]。研究表明，羊肚菌多变化的子实体外观导致确定种类比较困难，属中种间关系也比较混乱。此外，羊肚菌作为一种珍稀食药用真菌，明确其生长发育机制和提高抗逆性等都是为提高经济价值亟需解决的重要课题。因此，近年来在羊肚菌的分子鉴定、系统学研究、发育机制及功能基因等方面进行了大量研究，并取得了一定成果，为羊肚菌的分子鉴定提供了新技术，较全面地揭示了其种群的遗传多样性，同时为该类真菌的活性成分合成代谢调控、抗逆响应、菌核发育和子实体发育等分子机制的深入研究奠定基础。本文分析总结了近年来羊肚菌属的分子鉴定、系统学研究、活性成分及功能基因等分子生物学领域的文献资料，为将来对羊肚菌的分子探索和栽培产业的稳健发展提供新的认识和参考。

1 羊肚菌分子系统学研究

1.1 羊肚菌属分类地位

羊肚菌属隶属子囊菌亚门(Ascomycotina)盘菌纲(Discomycetes)盘菌目(Pezizales)羊肚菌科(Morchellacea)[3-4]。目前普遍认为羊肚菌科分为三个属：羊肚菌属、皱盘菌属(Disciotis)及钟菌属(Verpa)[5]。其中羊肚菌属准确名称依据《国际藻类、真菌、植物命名法规》和系统学分类中的规定应为MorchellaDill. ex Pers.。在羊肚菌科的三个属中，以羊肚菌属的营养方式、生活史因受生活环境及地理变化等诸多要素影响变得最为复杂，具有非常丰富的物种多样性。

1.2 羊肚菌属种类划分和遗传多样性

人们对羊肚菌属的种类鉴定及其类群划分一直存在着争议。早期倾向于先根据子实体形态进行初步区分，并在此基础上再划分为4个主要类群，包括黑色羊肚菌群(Black Morels)、红褐色羊肚菌群(Red Morels)、黄色羊肚菌群(Yellow Morels)及半开羊肚菌群(Semi-free Morels)[6-8]。也有研究发现羊肚菌属的聚类结果与地理间距有着显著的相关性，由此把我国现有记载的羊肚菌种类合为两个复合种群[9]。而对羊肚菌属种的鉴定一直在探究新的手段。近年来，分子标记基因测序为羊肚菌属的分类鉴定提供了更为有效的技术手段，目前研究者己经完全倾向于利用多基因联合系统发育分析(如ITS、ef1-α、rpb1、rpb2、LUS等)将该属划分成三个支系，分别为黑色羊肚菌支系(Elata Clade)、黄色羊肚菌支系(Esculenta Clade)以及变红羊肚菌支系(Rufubrunnea Clade)[10-13]。

目前进行的羊肚菌遗传多样性的研究多基于简单序列重复区间(inter-simple sequence repeat，ISSR)分子标记。应用此法，刘文丛等[9]对云南西北地区的50多株野生羊肚菌进行了遗传多样性和系统发育分析，发现该属种群内的遗传分化程度要低于种群间。He等[14]和Du等[15]首次对同一地理区间内两种羊肚菌种群间的遗传多样性进行了探究，证明两个种群存在显著差异，也说明二者作为同源物种却有着不一样的潜在进化史。还有研究基于ISSR分子标记对来源于不同单孢及萌发孔菌丝的166株羊肚菌进行了遗传多样性分析，结果发现，不同物种间的单孢菌株和单丝菌株的遗传差异显著，同一单孢不同萌发孔菌丝的菌株间有着较大的遗传分化现象[16]。利用ISSR分子标记的研究结果显示了羊肚菌属具有极其丰富的遗传多样性，即使同类群也存在较大差异，在黑色类群中梯棱羊肚菌(Morchellaimportuna)比六妹羊肚菌(Morchellasextelate)具有更广泛的遗传背景。

2 羊肚菌的分子鉴定技术

蛋白质免疫分析、同工酶分析及核酸分析等技术手段普遍运用于羊肚菌分子鉴定、分子系统学的探究。其中核酸分析技术运用较多，核酸序列同源性为传统的羊肚菌系统学分析提供了最显著的证据。核酸分析初期主要以rDNA 基因间隔序列(ITS)为主，大量分析结果也证实ITS序列适用于区分种间差异[17-21]。但有研究发现 ITS序列无法用在黑色羊肚菌类群相关种类的区分中[22]。而桂明英[23]基于自测ITS序列并结合基因库数据研究了云南省西北地区21个羊肚菌样品的系统发育，结果证明ITS序列能够将各个样品很好地区分开，但不能将目前由形态学建立的各个种群更好地分开；刘文丛等[24]基于ITS序列分析也认为该区域的野生羊肚菌属分子鉴定结果与基于形态学的分类结果存在差异。2000年，国外有学者提出了多基因联合分析法进行物种界定，该方法的出现也为羊肚菌属的分类研究提供了新思路[25]。在O′ Donnell 首先利用LSU+ef1-α+rpb1+rpb2四基因片段联合起来对羊肚菌属系统发育进行研究后，这种方法被广泛应用[26-29]。在此基础上，杜习慧等[30-31]在研究中则采用了五基因联合分析，认为该属由包括33个黑色羊肚菌、27个黄色羊肚菌和1个变红羊肚菌的支系构成，在这61个系统发育学物种中我国共分布有30个。熊川等[32]应用此法对采自四川南充的一株羊肚菌进行分子鉴定后，归入黄色羊肚菌支系。

核酸分子标记为羊肚菌种质资源鉴定提供了一类既科学合理又快速简便的方法。此类方法中使用最多的一种是基于聚合酶链式反应(PCR)的分子标记法，如Shen等[33]筛选出一对用于扩增羊肚菌190 bp ITS片段的引物MS1F/MS1R，能够便捷地进行羊肚菌的鉴定。孟清等[34]则通过高通量转录组测序技术对来自青海大通县的小海绵羊肚菌的菌丝体进行了分析，阐明了菌丝体转录组SSR的总体特征，挑选出适合开展种质资源评价和遗传多样性分析的几对高频率、高多态性的SSR引物分子标记。多基因联合矩阵序列分析及核酸分子标记技术的探索，可以对羊肚菌进行较为准确快速地分子鉴定，这给羊肚菌种质资源的科学利用提供了更可靠的参考依据。

3 羊肚菌功能基因研究

自发现羊肚菌以来，虽然人们对其探究的历史已达上百年，但有关羊肚菌完整生活周期及遗传机制等问题至今没有明确。在分子水平上探索羊肚菌的发育机制，分析羊肚菌染色体组型与遗传图谱，克隆与重组相关功能基因，进行功能研究显得尤为重要。

3.1 生活史

羊肚菌是具有复杂生活史的子囊菌，虽然早于1990年Volk等[35]就认为该类真菌具有较完整的生活史，但至今很多问题未明，对该领域的探索一直在进行中。曾有研究基于羊肚菌交配位点处的基因序列设计引物，用以研究亚欧地区14个羊肚菌种群的二百多个子囊孢子的交配型，在分子水平上显示该类真菌繁殖方式为异宗结合，且在其生活周期的大部分阶段存在方式为单倍同核体[36]。另有研究运用二代测序技术对同一梯棱羊肚菌不同极性单孢测序，并对基因功能进行注解，明确了该羊肚菌中不同交配型单孢间的基因区别[37]。贺新生等[38]通过对9个羊肚菌物种的研究发现羊肚菌单孢培养物菌丝间不发生有性融合，单个孢子自身可孕进而单孢出菇。这些研究对该类真菌的生活周期产生了新的认知，对其生活史的认真探究有助于羊肚菌栽培产业的稳健发展。

3.2 凝集素合成相关基因

动植物和微生物体内普遍存在凝集素，该物质是一类具有抗菌、抑制肿瘤及提高免疫力等功效的糖蛋白，含有糖基特异性识别结合结构域[39]。在大型食药用真菌中凝集素的种类非常丰富，对其研究已成为近年来关注的热点，通过凝集素编码基因MIL的克隆外源表达是获得该类物质的一种方式。舒芳等[40]通过克隆获取了梯棱羊肚菌凝集素MIL基因片段后，就其生长发育不同阶段中此基因的表达量进行了分析，发现其可能在菌核形成和幼菇阶段起到关键的调控功能；就该基因可溶性重组蛋白MIL-His的凝血和免疫活性研究发现，重组蛋白既对兔红细胞有着非常显著的凝集活性，也增强了小鼠脾脏淋巴细胞增殖率的活性。上述研究为开发羊肚菌凝集素的药用价值提供了一定的基础，但目前关于羊肚菌凝集素的研究报道较少，其分子调控机理尚不明确，需进行深入研究。

3.3 漆酶合成相关基因

漆酶属于铜蓝氧化酶类，可参与木质素的氧化分解，对真菌分解利用木质纤维素起着重要作用[41]。典型的漆酶通常属于辅助活性酶第一家族第一亚族(AA11家族)，部分AA12家族酶蛋白兼具漆酶活性。早期Kellner等[42]曾从羊肚菌科中克隆到多铜氧化酶基因并进行了测序，但并未对基因的功能进行验证。近期对梯棱羊肚菌“川羊肚菌1号”(SCYDJ1-A1)全基因组的研究发现其缺乏AA11家族的漆酶基因，只有两个AA13家族和一个AA12家族的多铜氧化酶基因[43]。在人工栽培中AA13家族的MiLacA基因表达水平远高于同家族的MiLacB，纯化酶的生化特性表明该酶同时具有漆酶和多酚氧化酶活性，能被Fe2+强烈抑制，热稳定性在目前已知的漆酶中处于前列，在梯棱羊肚菌营养生长阶段可能起着分解利用木质纤维素的作用[44]。而对AA12家族酶基因的表达活跃阶段、酶活性、生化特性等的初步研究发现，该基因在外源营养袋和土壤中的营养菌丝中低表达，而在子实体原基及子实体中表达较活跃，异源表达表现出亚铁氧化酶与漆酶双重活性，系在大型子囊真菌中首次发现[45]。为进一步研究铁元素代谢与漆酶活性在羊肚菌子实体形成与发育过程中的作用提供了启示。

3.4 交配型基因

子实体形成与发育是大型真菌重要的生理过程，除了需要适宜的温度、湿度、光照和空气等环境条件以及相应的营养条件外，还受其特有的遗传因子控制，其中在调控真菌有性发育过程中交配型基因(Mat)就是关键位点。已有研究证明梯棱羊肚菌是一种以异宗结合交配方式繁殖的真菌，两个交配型位点在不同的细胞核上可以用来鉴别不同的核型[46-48]。杜习慧等[49]关于黑色羊肚菌支系14个物种的有性生殖方式和交配型基因的研究结果显示，Mat1-1-1和Mat1-2-1基因能很好地区分黑色羊肚菌支系类群内近缘物种，并且交配型基因在黑色羊肚菌支系子实体分布和自然群体分布中呈现差异分布现象等，对黑色羊肚菌有性繁殖方式的研究结论均支持黑色羊肚菌支系为异宗配合类的真菌。研究还显示，相比Mat1-2-1，Mat1-1-1在某些黑色羊肚菌物种中具有更大的竞争优势，并且缺失交配型基因易对生产产生不利影响[36]。而这种现象在另外一些研究中并不明显，刘伟等[50]对采集自不同地区的羊肚菌子囊果中两种交配型基因进行检测，发现43.96%只存在一种类型，并且两种类型的基因缺失几率相似，由于在组织分离后的培养物中两种类型的基因缺失的几率虽不同，但纯化后的菌落形态近似，所以组织分离物最初的菌落形态并不适合用作确定分离物交配型基因是否完整的筛选标记。具有异宗结合这一类型的生活史需要两类互补交配型彼此作用，单一交配型菌株并不具有出菇能力，所以实际栽培时，首先要利用分子标记技术检验组织分离物交配型基因的完整性，这是确保出菇的必需环节。

3.5 菌核发育相关基因

在羊肚菌完整的生活史中，菌核的形成占据着重要地位，我国已驯化栽培的羊肚菌在人工生产过程中可形成菌核[51]。提取尖顶羊肚菌(M.conica)产菌核与不产菌核菌株的菌丝样品总RNA，通过RT-PCR检测显示两者在通透酶、周期蛋白依赖性激酶、脂蛋白等基因表达上存在一定的差异[52]。利用比较转录组学技术分析梯棱羊肚菌菌核形成过程中菌丝、起始、成熟三个阶段的样品，结果表明，在梯棱羊肚菌菌核形成过程中，差异表达基因主要处在初级代谢阶段，比如三大类物质蛋白质、脂肪和碳水化合物的代谢以及能量代谢等[53]。但是目前对菌核形成机制及菌核数量与子实体产量之间的关系均不明确，因此现有工作仍缺乏对于生产实践的指导性。

3.6 抗逆相关基因

羊肚菌的生长发育受逆境胁迫的影响，在其栽培规模不断扩大的今天，土壤重金属镉超标等问题给羊肚菌菌丝生长及其子实体质量安全均构成潜在的威胁。Liu等[54]通过比对梯棱羊肚菌的参考基因组序列，发现存在镉胁迫响应基因(ATX1)，可能与重金属镉的代谢相关；梯陵羊肚菌ATX1基因的沉默及超表达实验证明，该基因表达量的增加会提高梯棱羊肚菌对于镉的敏感度，降低菌丝对镉的抗性[55]。可见ATX1基因极有可能以一种反馈调节的机制在梯棱羊肚菌镉胁迫响应方面起着关键作用，不过其在梯棱羊肚菌镉代谢中的具体作用机理并不明确，仍需做进一步的研究。

3.7 子实体形成机制研究

虽然有些羊肚菌种类经过驯化已大规模人工栽培，但因其子实体形成机制尚不清楚，难以达到稳定生产。为了探讨羊肚菌子实体形成的机制，Hao等[56]分别对羊肚菌菌丝体和幼子实体进行了转录组分析，发现12 500多个差异表达基因多数集中在前体代谢物质和能量生产、碳水化合物代谢和氧化还原酶活性的功能基因类别；酶活性检测结果表明，从菌丝期到幼子实体期，碳水化合物活性酶、氧化还原酶、过氧化氢酶和线粒体酶复合体(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)的活性水平明显升高；此外，编码碳水化合物活性酶、线粒体蛋白、氧化还原酶和热休克蛋白的基因在幼子实体期的表达水平高于菌丝期，通过实时荧光定量PCR也发现相似趋势[57]。因此，子实体在幼菇阶段各种生理活性变得旺盛，此时碳水化合物分解代谢和能量代谢显著增强，同时生长环境、温度变化也影响了子实体的形成。

4 展 望

羊肚菌的分子生物学研究已经取得了可喜的成果，利用分子标记实现了羊肚菌属方便快捷的分子鉴定，较全面地显示了该属内种群的遗传多样性和亲缘关系，利用组学技术初步揭示了羊肚菌菌核发育和子实体形成的机制，此外还克隆、表达了某些与羊肚菌抗逆和生长发育相关的基因。但作为重要的食药用真菌之一，羊肚菌的分子生物学研究还不够系统、全面，需要进一步深化。后续羊肚菌的分子生物学研究工作，第一应侧重于新型分子标记的挖掘。DNA分子标记是对生物个体在核酸水平上进行遗传差异检测的有效手段，应用广泛。目前在羊肚菌研究中得到应用的只有随机分子标记和少数种类的目标分子标记，其他种类的新型羊肚菌分子标记还有待开发。第二应注重羊肚菌具备药用价值的活性成分在生物合成途径中起关键作用的酶基因的挖掘和基因的调控机制分析。目前只有MIL等少量基因被克隆获得基因的全长序列，对于转录后或翻译水平调控研究报道极少。所以综合运用组学技术来系统揭示羊肚菌活性成分的遗传信息表达和调控机制，为将来分析、合成及利用活性成分打下基础。第三要注重羊肚菌菌核形成和子实体发育的分子机制研究，目前虽有羊肚菌部分重要的功能基因已得到一定诠释，但对于羊肚菌重要发育基因的功能、重要代谢产物的代谢途径以及分子调控机理的研究很少，从而限制了对这类珍稀食药用真菌的进一步开发和利用。