潘琪 张旺明 罗非 徐如祥

1海南医学院第一附属医院神经外科（海口570102）；2南方医科大学珠江医院神经外科（广州510280）；3中国科学院心理研究所（北京100101）；4四川省人民医院神经外科（成都610072）

帕金森病是一种多见于中老年人的神经退行性疾病，以静止性震颤、运动缓慢、肌强直和姿势步态障碍为症状特征，以黑质多巴胺能神经元变性和纹状体内多巴胺严重减少为病理学特点［1-2］。帕金森病的病理变化引起大脑皮层［3］、基底神经节［4］、丘脑［5］和脑干神经核团［6］等数个区域的神经电活动出现改变，包括：神经元放电频率改变、神经元放电模式改变和场电位改变等，最终造成了帕金森病的运动症状［7］。其中，帕金森病情况下，有关丘脑内神经核团的神经元放电活动的研究相对较少，且研究结果也并不完全一致［8］。丘脑腹内侧核（ventromedial thalamic nucleus，VM）是运动丘脑的关键核团之一，参与构成了大脑皮层-基底神经节-丘脑-大脑皮层的运动环路［9］。ROLLAND等［10］发现帕金森病大鼠模型丘脑腹内侧核的代谢活动明显减低，这可能反映了丘脑腹内侧核电活动的降低。但帕金森病条件下丘脑腹内侧核的放电活动改变仍未完全明确。本研究应用神经元单位放电在体多通道同步记录方法研究6-羟基多巴胺（6-OHDA）单侧帕金森病模型大鼠丘脑腹内侧核的电活动变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD 大鼠12 只（购自军事医学科学院实验动物中心），体质量250～300 g，自由饮食、饮水，室温维持在（22 ± 2）℃。所有实验操作符合南方医科大学动物伦理学要求。

1.2 试剂与仪器 6-OHDA（H4381）、阿扑吗啡（apomorphine，APO）（D004）、地昔帕明（D3900）、L-抗坏血酸（A0278）、小鼠抗酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）抗 体（T1299）、多 聚 甲 醛（158127）、甲酚紫（114375）购自Sigma-Aldrich 公司。免疫组织化学检测试剂盒（SP-9002）和DAB试剂盒（ZLI-9032）购自北京中杉金桥公司。大鼠脑立体定位仪（51603 型，stoelting 公司），记录电极（2*4 型，美国东乐公司），神经元单位放电在体多通道同步记录系统（cerebus128 通道系统，美国Blackrock 公司），电生理数据分析软件（NeuroExplorer，美国plexon 公司），电损毁仪（53500 型，Ugo Basile 公司）。

1.3 实验流程 12 只SD 大鼠喂养7 d 以适应新环境；完成大鼠脑部埋置不锈钢管和记录电极的手术；大鼠手术后恢复1 周，然后完成建立帕金森病模型前的在体电生理记录实验；进行大鼠帕金森病模型的制备和鉴定；对成功大鼠模型进行在体电生理记录实验；电生理记录实验完成后，处死实验动物，取脑组织做病理检查。

1.4 大鼠脑部埋置不锈钢管和记录电极手术 腹腔注射1%戊巴比妥钠（50 mg∕kg）麻醉大鼠。将大鼠固定在脑立体定位仪上。参照PAXINOS 等［11］编写的大鼠脑立体定位图谱，右侧内侧前脑束上方2 mm 处的坐标是前囟后2.0 mm、右侧2.0 mm和腹侧6.1 mm，此坐标是用于后期注射6-OHDA的不锈钢管置入端的坐标；双侧丘脑腹内侧核坐标是前囟后2.9 mm，左侧或右侧1.4 mm 和大脑皮层下6.9 mm。备皮、常规消毒，磨开坐标点相应区域的颅骨，使用脑立体定位仪将不锈钢管置入端和记录电极尖端埋置于相应坐标处。再用牙科水泥将不锈钢管和记录电极固定在大鼠颅骨表面。动物手术后恢复7 d，然后进行在体电生理记录实验。

1.5 神经元单位放电在体多通道同步记录 把大鼠放进大小为0.4 m × 0.4 m × 0.3 m 的箱中，再把记录电极连接信号采集芯片，启动神经元单位放电在体多通道同步记录系统，采集动作电位。应用窗筛法筛选单个神经元放电。对各通道记录到的神经元进行筛选后，记录每个动作电位的时间点。同时启动视频系统，对动物的活动进行录像。使用Neuroexplorer 电生理数据分析软件离线分析大鼠无肉眼可见活动时的电生理数据。对神经元平均放电频率和放电模式进行了考察。其中，将神经元放电模式分为爆发放电和非爆发放电。

1.6 建立帕金森病大鼠模型 大鼠腹腔注射地昔帕明（15 mg∕kg）。0.5 h 后用微量注射器将12 μg∕4 μL 6-OHDA（用含有0.2 %L-抗坏血酸的生理盐水配置）通过不锈钢管注入右侧内侧前脑束内。6-OHDA 注入2 周后，采用APO 诱导旋转测试评价单侧帕金森病大鼠模型建立情况。对大鼠予皮下注射APO（0.25 mg∕kg）。然后，将大鼠放入半球形容器内。给药10 min 后记录大鼠向毁损对侧旋转的次数，共记录0.5 h。成功模型的标准：大鼠向毁损对侧旋转的平均圈数大于7 圈∕min［12-13］。

1.7 标记记录电极尖端的位置 用8%水合氯醛（腹腔注射，400 mg∕kg）麻醉动物。向记录电极施加20 μA 的阳极直流电，时长20 s。将大鼠固定在实验板上。用37 ℃生理盐水（300 mL∕只）从左心室快速灌注，再用4%多聚甲醛（含有5%亚铁氰化钾，400 mL∕只）灌注。取出鼠脑，并用后者固定6 h。

1.8 黑质TH免疫组织化学染色和神经元计数 对鼠脑进行冰冻切片，切片厚度为30 μm。按免疫组织化学检测试剂盒说明书进行大鼠中脑组织TH 免疫组织化学染色。小鼠抗TH 抗体的稀释比例是1∶1 000。神经元数目计算方法：取前囟后4.8、5.2、5.6 mm 的切片各1 张，在显微镜下对左右两侧黑质的TH 阳性神经元进行计数，并将3 张切片左右侧神经元数目分别相加，得出每只大鼠单侧黑质TH 阳性神经元数目。黑质内神经元残存率以右侧黑质与左侧黑质的TH 阳性神经元数目的百分比表示。

1.9 丘脑腹内侧核的甲酚紫染色 对鼠脑进行冰冻切片，切片厚度为40 μm。用0.5 %甲酚紫染色0.5 h。用双蒸水分化5 min。用梯度酒精脱水；用二甲苯透明切片；最后进封片。

1.10 统计学方法 记录电极尖端在丘脑腹内核内的成功大鼠模型的数据用于统计学分析。数据采用SPSS 13.0 软件分析。结果采用均数±标准差表示。神经元平均放电频率的比较采取重复测量方差分析。模型建立前和模型建立后的神经元放电模式数据采取配对χ2检验进行比较。双侧丘脑腹内侧核的神经元放电模式数据采取成组χ2检验进行比较。P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 帕金森病大鼠模型的建立 本研究从12 只大鼠中获得9 只成功的帕金森病模型大鼠，模型建立的成功率约为75%。模型建立2 周后，成功的模型大鼠皮下注射阿扑吗啡（0.25 mg∕kg）后出现向毁损对侧快速旋转的行为。模型大鼠的毁损侧黑质的TH 阳性神经元大量丧失（图1），神经元残存率为2.1%～13.5%。

图1 黑质TH 免疫组织化学染色Fig.1 TH immunohistochemical staining of substantia nigra

2.2 记录电极尖端的解剖位置 大鼠脑立体定位图谱判断记录电极尖端是否在丘脑腹内侧核内（图2）。在模型大鼠中，6 个记录电极尖端在左侧丘脑腹内核内，7 个记录电极尖端在右侧丘脑腹内侧核内。全部记录电极尖端的位置见图3。

图2 丘脑腹内侧核的甲酚紫染色Fig.2 Cresol purple staining of VM

图3 记录电极尖端的位置。Fig.3 Thelocations of electrode tips

2.3 丘脑腹内侧核神经元平均放电频率 本研究在9 只帕金森病模型大鼠的左侧丘脑腹内侧核内共有46 个神经元被记录到，在右侧丘脑腹内侧核内共有54 个神经元被记录到。双侧丘脑腹内侧核在模型建立前和模型建立后的神经元平均放电频率如图4 所示。模型建立前的左侧和右侧丘脑腹内侧核神经元的平均放电频率分别是（14.516 9±0.575 0）Hz 和（15.733 7±0.5360 8）Hz，两者差异无统计学意义（t= 1.547，P= 0.125）。模型建立后的左侧和右侧丘脑腹内侧核神经元的平均放电频率分别是（15.528 7 ± 0.572 69）Hz 和（5.698 1 ±0.279 1）Hz，两者差异有统计学意义（t= 15.431，P＜0.001）。和模型建立前比较，模型建立后的右侧丘脑腹内侧核神经元的平均放电频率显著下降（F=306.701，P＜0.001）。和模型建立前比较，模型建立后的左侧丘脑腹内侧核神经元的平均放电频率无显著变化（F=1.331，P=0.255）。

图4 丘脑腹内侧核神经元平均放电频率Fig.4 The mean firing rate of neurons in VM

2.4 丘脑腹内侧核神经元放电模式 左侧丘脑腹内侧核内不同放电模式的神经元数量见表1。模型建立前和模型建立后的神经元爆发放电率分别是21.7%和17.4%。与模型建立前相比，模型建立后的左侧丘脑腹内侧核内爆发放电神经元的比例无显著变化（P= 0.688）。右侧丘脑腹内侧核内不同放电模式的神经元数量见表2。模型建立前和模型建立后的神经元爆发放电率分别是14.8%和44.4%。与模型建立前相比，模型建立后的右侧丘脑腹内侧核爆发放电神经元比例明显增加（P=0.001）。模型建立前，与左侧丘脑腹内侧核相比较，右侧丘脑腹内侧核内爆发放电神经元比例差异无统计学意义（χ2= 0.807，P=0.369）。模型建立后，与左侧丘脑腹内侧核相比较，右侧丘脑腹内侧核内爆发放电神经元比例明显增加（χ2=8.355，P=0.004）。

表1 左侧丘脑腹内侧核内不同放电模式神经元的数量Tab.1 The number of neurons with different discharge patterns in leftVM

表2 右侧丘脑腹内侧核内不同放电模式神经元的数量Tab.2 The number of neurons with different discharge patterns in right VM

3 讨论

本研究发现6-OHDA 单侧帕金森病大鼠模型丘脑腹内侧核神经元的平均放电频率显著下降，多数神经元的放电模式发生改变，爆发放电神经元的比例增加。

本研究利用神经元单位放电在体多通道记录方法，发现6-OHDA 单侧帕金森病大鼠模型丘脑腹内侧核神经元的放电频率减小，该结果和经典的“放电频率”模型相符合［14］。该模型推测帕金森病患者黑质-纹状体多巴胺能神经通路变性通过直接通路和间接通路引起作为基底神经节输出核团的苍白球内侧部和黑质网状部的神经活动增强。而后两者向丘脑腹内侧核发出大量利用抑制性神经递质GABA 的神经纤维投射。因此，在帕金森病情况下，苍白球内侧部和黑质网状部的神经活动出现增强，丘脑腹内侧核的神经活动被抑制，从而表现出神经元放电频率的减小。早期研究发现帕金森病大鼠模型丘脑腹内侧核的代谢活动减弱［10，15］，这可能反映了丘脑腹内侧核神经元放电活动的降低。丘脑腹内侧核发出大量兴奋性神经纤维分布至大脑皮质的多个部位［16］，在动作启动、动作选择和运动活力的神经编码中起重要作用［17］。丘脑腹内侧核神经活动的降低，对大脑皮质的活化下降，最后引起帕金森病患者的随意动作减少、动作迟缓等表现。有研究报道高频率电刺激大鼠黑质网状部可以增加丘脑腹内侧核的神经元放电频率，且大鼠的运动障碍表现得到改善［18］；另外，有研究者发现高频电刺激帕金森病模型大鼠的束旁核，丘脑腹内侧核神经元的放电频率显著升高［19］。综合上述结果，可以推论丘脑腹内侧核神经元放电活动的下降参与了帕金森病运动障碍症状的发生机制，而提高丘脑腹内侧核神经元放电活动可能改善帕金森病运动障碍症状。

本研究同时发现帕金森病模型大鼠丘脑腹内侧核内爆发放电神经元的比例增加。该结果和使用其他模型进行研究的发现相类似［20-21］。很多研究发现，作为基底神经节输出核团的黑质网状部和苍白球内侧部神经元的放电模式在帕金森病条件下出现了显著变化，更多的神经元转变成爆发式放电［22］。这种电活动的变化可能通过黑质网状部和苍白球内侧部向丘脑腹内侧核发出的神经纤维传导至后者。目前，帕金森病时这种神经元放电模式的变化和运动症状的关系尚未阐明清楚。有研究发现，在帕金森病模型中，丘脑腹内侧核出现同步化的神经元活动，而这种改变促进了整个基底神经核-丘脑-皮层网络的高β 振荡的出现，而后者被认为是导致帕金森病运动症状的关键神经电活动改变［23］。

6-OHDA 单侧帕金森病大鼠模型是一种常用的帕金森病动物模型，能够部分模拟出帕金森病的病理改变和临床症状［24］。其中，将较大剂量的6-OHDA 注射入大鼠一侧的内侧前脑束能够严重毁损一侧黑质-纹状体多巴胺能神经通路，导致黑质多巴胺能神经元和纹状体多巴胺能神经纤维大量丧失，大鼠表现出明显运动障碍行为，类似中晚期帕金森病患者的病理改变和运动症状。通过这种方法建立的单侧帕金森病模型在帕金森病电生理研究中被广泛应用［25］。单侧帕金森病模型仅一侧黑质-纹状体多巴胺能神经通路被损毁，而另一侧通路仍然完好，后者被认为是良好的内部参照物。本研究也确实发现健侧丘脑腹内侧核在模型建立前和模型建立后的电活动无显著变化。有研究报道，生物的觉醒水平影响神经系统的电活动，而帕金森病能够导致生物的觉醒水平发生变化［26］。为了排除帕金森病模型建立后，大鼠的觉醒水平的改变对神经元电活动变化的影响，本研究比较了健侧和毁损侧的实验数据。为了排除一侧毁损对另一侧核团的电活动的影响，本研究又对模型建立前和模型建立后的数据进行了比较。同时使用这两种分析方法，在一定程度上提高了研究结果的可信度。

综上所述，本研究发现6-OHDA 单侧帕金森病模型大鼠丘脑腹内侧核神经元放电频率下降，且爆发放电神经元比例增加，丘脑腹内侧核可能在帕金森病的病理生理机制中扮演重要角色。