周方 孙波 于志丹 李小芹

河南省儿童医院（郑州大学附属儿童医院，郑州儿童医院）消化科（郑州450053）

胆汁淤积是一种因胆汁形成、分泌和排泄过程中任一环节出现障碍而引发的临床综合征。肠道微生物在肝脏病理生理过程中发挥重要作用，能通过改变肠道通透性、调节胆碱代谢、调节胆汁酸代谢等导致肝脏炎症和（或）纤维化［1］。临床上已证明微生态制剂可以作为一种治疗手段来恢复肠道菌群的平衡，对缓解胆汁淤积性肝病具有良好的效果，但机制尚不完全明确［2］。本研究应用α-萘异硫氰酸酯（alpha-naphthylisothiocyanate，ANIT）建立大鼠急性肝内胆汁淤积型肝炎模型，探讨益生菌通过作用于Toll 样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）∕核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信号转导通路治疗淤胆性肝病的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性SD大鼠40只，体质量（200±20）g，由郑州大学实验动物中心提供。动物许可证号：SCXK 豫，2017-0001。

1.2 药品与试剂 ANIT（美国Sigma 公司，生产批号：N4525-10）；益生菌制剂（复方嗜酸乳杆菌，每片含嗜酸乳杆菌5 × 106CFU，通化金马药业集团股份有限公司生产，批号：国家准字H10940114）；所用引物均由武汉金开瑞生物工程有限公司合成；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（南京建成公司，批号：A001-2），丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成公司，批号：A003-1）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（伊莱瑞特生物科技有限公司，批号分别为：E-EL-R2856c，E-EL-R0012c，E-EL-R0015c）；总RNA提取试剂盒（北京天根科技生化有限公司，批号：DP431）；逆转录及实时荧光定量PCR 试剂盒（日本，TaKaRa 公司，批号分别为：RR037A，RR820A）；全蛋白提取试剂盒（凯基生物科技发展有限公司，批号：KGP250）；兔抗大鼠NF-κB p65 抗体和山羊抗兔IgG-HRP 二抗（英国，Abcam 公司，批号分别为：ab16502，ab205718）；兔抗大鼠GAPDH 抗体（美国，Affinity Biosciences公司，批号：AF7021）；兔抗大鼠TLR4 抗体（美国，Affinity Biosciences公司，批号：AF7017）。

1.3 仪器 贝克曼库尔特AU680 自动生化分析仪（美国，贝克曼库尔特公司）；LightCycler 480II 实时荧光定量PCR 仪（瑞士，Roche 公司）。

1.4 动物分组及模型制备 40 只SD 大鼠正常喂养5 d 后按随机数字表分为正常对照组、模型组、模型+益生菌组、正常+益生菌组，每组10 只。ANIT 用橄榄油配制成15 g∕L；复方嗜酸乳杆菌用生理盐水配制成1×1010CFU∕L 的混悬液备用。模型+益生菌组和正常+益生菌组给予复方嗜酸乳杆菌5×107CFU∕（kg·d）灌胃14 d，正常对照组和模型组灌服生理盐水5 mL∕（kg·d），均为1 次∕d，并于实验第12 天给药后4 h，模型组和模型+益生菌组按75 mg∕kg 给予ANIT 灌胃1 次建立肝内胆汁淤积模型，正常对照组及正常+益生菌组等量橄榄油处理，第14 天给药后4 h（模型建立48 h）用100 g∕L 水合氯醛250 mg∕kg 腹腔注射麻醉实验动物，取血、分离血清，-20 ℃保存备检；留取肝脏标本，-80 ℃保存。

1.5 血清学指标检测 将留取的血清交由河南省儿童医院检验科，经全自动生化分析仪测定各组血清中总胆红素（TBiL）、直接胆红素（DBiL）、总胆汁酸（TBA）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）。

1.6 肝脏组织中MDA 和SOD 活性含量检测 黄嘌呤氧化酶法检测肝组织中SOD 含量，硫代巴比妥酸比色法检测MDA 水平。肝脏组织匀浆后根据南京建成公司试剂盒说明书进行操作。

1.7 用ELISA 方法检测肝脏组织中TNF-α、IL-6、IL-1β 水平 肝脏组织匀浆后根据试剂盒说明书操作方法，用ELISA 检测肝组织中TNF-α、IL-6、IL-1β 含量。

1.8 用RT-qPCR检测肝组织NF-κB、TLR4 mRNA表达水平 于冰上取约100 mg 肝组织按照总RNA提取试剂盒说明进行总RNA 提取，清除残存的基因组DNA 后，测定其浓度，根据逆转录试剂盒说明书反转录为cDNA，并置于-20 ℃保存。进行实时荧光定量PCR 检测，反应条件：95 ℃预变性30 s，扩增40 个循环（95 ℃5 s，60 ℃20 s）。在PCR反应过程中，设定无cDNA 样品的空白管作为阴性对照，引物序列见表1。以管家基因GAPDH 为内参，用2-ΔΔCt对各基因的原始拷贝数进行相对定量分析。

表1 实时荧光定量RT-PCR 引物序列Tab.1 The primer sequences for RT-qPCR

1.9 用Western blot 法检测肝组织NF-κB、TLR4蛋白表达水平 按试剂盒说明提取肝脏组织总蛋白后BCA法测定蛋白浓度，蛋白上样量均为40 μg，经SDS-PAGE 电泳分离，转膜，脱脂奶粉封闭，加入目的蛋白NF-κB（1∶2 000）、TLR4（1∶1 000）和内参蛋白GAPDH（1∶5 000）的一抗4 ℃孵育过夜，洗涤后室温孵育辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶5 000）1 h，ECL 化学发光成像系统成像，AlphaEaseFC 软件处理系统测定分析结果，判断各组NF-κB、TLR4蛋白表达水平。

1.10 统计学方法 采用SPSS 21.0 统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清肝功能指标比较 与正常对照组比较，模型组TBA、TBiL、DBiL、AST 和ALT 均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型+益生菌组TBA、TBiL、DBiL、AST 和ALT 均低于模型组（P＜0.05）；正常+益生菌组与正常对照组比较各指标差异无统计学意义（P＞0.05，表2）。

表2 各组大鼠TBiL、DBiL、ALT、AST 和TBA 结果比较Tab.2 Comparison of TBiL，DBiL，ALT，AST and TBA in rats of each group ±s

表2 各组大鼠TBiL、DBiL、ALT、AST 和TBA 结果比较Tab.2 Comparison of TBiL，DBiL，ALT，AST and TBA in rats of each group ±s

注：与正常对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与模型组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01

组别正常对照组模型组模型+益生菌组正常+益生菌组F 值P 值n 10 10 10 10 TBiL（μmol∕L）1.08±0.19 78.36±7.47**59.92±6.32**##1.12±0.26##358.88＜0.001 DBiL（μmol∕L）0.32±0.07 48.13±5.67**42.23±3.03**#0.28±0.05##391.47＜0.001 ALT（U∕L）48.61±6.72 611.24±96.70**386.63±67.26*##52.79±5.86##195.27＜0.001 AST（U∕L）26.83±3.64 425.33±45.98**354.15±34.64**##28.12±2.89##368.49＜0.001 TBA（μmol∕L）8.02±1.47 94.28±8.16**82.27±7.70**#7.93±1.14##205.32＜0.001

2.2 各组肝组织SOD 活性、MDA 含量及TNF-α、IL-6、IL-1β水平比较 模型组与正常对照组比较，SOD 活性明显降低（P＜0.05），MDA、TNF-α、IL-6和IL-1β水平增加（P＜0.05）；模型+益生菌组SOD活性明显高于模型组（P＜0.05），MDA、TNF-α、IL-6和IL-1β 含量低于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；正常+益生菌组与正常组比较，SOD、MDA、TNF-α、IL-6 和IL-1β 含量差异无统计学意义（P＞0.05，表3）。

表3 各实验组大鼠SOD、MDA、TNF-α、IL-6 和IL-1β 结果比较Tab.3 Comparison of SOD，MDA，TNF-α，IL-6 and IL-1β in rats of each group ±s

表3 各实验组大鼠SOD、MDA、TNF-α、IL-6 和IL-1β 结果比较Tab.3 Comparison of SOD，MDA，TNF-α，IL-6 and IL-1β in rats of each group ±s

注：与正常对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与模型组比较，#P ＜0.05,##P ＜0.01

组别正常对照组模型组模型+益生菌组正常+益生菌组F 值P 值n 10 10 10 10 SOD（U∕mg）121.36±8.47 72.83±5.79**88.23±8.16*##126.94±9.52##95.36＜0.001 MDA（nmol∕mg）0.84±0.09 1.89±0.27**1.65±0.18**#0.81±0.07##127.55＜0.001 TNF-α（pg∕mg）116.04±13.31 345.13±46.30**279.27±38.76**##120.37±14.87##122.71＜0.001 IL-6（pg∕mg）86.46±17.14 247.72±41.37**213.35±32.17**#85.20±19.48##88.28＜0.001 IL-1β（pg∕mg）159.24±32.69 518.30±89.63**467.62±71.14**##151.70±29.57##205.64＜0.001

2.3 各组肝组织NF-κB、TLR4 mRNA表达比较模型组NF-κB、TLR4 mRNA 表达量高于正常对照组（P＜0.05）；模型+益生菌组与模型组比较，NF-κB、TLR4 mRNA 表达量明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；正常+益生菌组NF-κB、TLR4 mRNA 表达与正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05，表4）。

表4 各实验组大鼠NF-κB 和TLR4 mRNA 表达的比较Tab.4 Comparison of NF-κB and TLR4 mRNA in rats of each group ±s

表4 各实验组大鼠NF-κB 和TLR4 mRNA 表达的比较Tab.4 Comparison of NF-κB and TLR4 mRNA in rats of each group ±s

注：与正常对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与模型组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01

组别正常对照组模型组模型＋益生菌组正常＋益生菌组F 值P 值n 10 10 10 10 NF-κB 0.97±0.07 2.79±0.81**2.19±0.54**#0.90±0.07##33.26＜0.001 TLR4 1.53±0.39 4.01±0.79**3.15±0.53**#1.50±0.24##50.19＜0.001

2.4 各组肝组织NF-κB、TLR4 蛋白表达比较 与mRNA 表达水平一致，模型组NF-κB、TLR4 蛋白表达量高于正常对照组（P＜0.05）；模型+益生菌组NF-κB、TLR4 蛋白表达量低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；正常对照组与正常+益生菌组比较，NF-κB、TLR4 蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05，图1 及表5）。

图1 Western blot 检测各实验组大鼠NF-κB、TLR4 蛋白表达Fig.1 The protein expression of NF-κB and TLR4 in rats of each group by Western blot

表5 各实验组大鼠NF-κB 和TLR4 蛋白表达的比较Tab.5 Comparison of NF-κB and TLR4 protein in rats of each group ±s

表5 各实验组大鼠NF-κB 和TLR4 蛋白表达的比较Tab.5 Comparison of NF-κB and TLR4 protein in rats of each group ±s

注：与正常对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与模型组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01

组别正常对照组模型组模型＋益生菌组正常＋益生菌组F 值P 值n 10 10 10 10 NF-κB 0.56±0.06 1.33±0.52**1.01±0.39**#0.49±0.06##19.35＜0.001 TLR4 0.29±0.05 0.69±0.15**0.49±0.14**#0.33±0.06##16.73＜0.001

3 讨论

近年来，随着对肠-肝轴的不断深入研究发现，作为肠道的重要组成的肠道菌群在诱导和促进肝内胆汁淤积性肝病发生和发展过程中发挥了重要的作用［2］。ANIT 诱导大鼠产生生化和病理改变与人肝内胆汁淤积性肝病相似，已被广泛应用于肝内胆汁淤积动物模型的建立［3］。因此，本实验应用这一模型进行研究。

人类肠道菌群是一个动态的、复杂的生态系统，在种类和数量上保持相对稳定、制约与平衡［4］。胆汁酸可影响肠道细菌增长，调节肠道菌群种类、数量，具有清洁功能和直接抑菌作用［5］。肝内胆汁淤积时，胆汁分泌、排泄异常，进入肠道的胆汁酸减少，肠道菌群的种类、数量改变，肠道黏膜机械、化学、生物及免疫屏障均被损害，肠道细菌及代谢产物如内毒素等通过“肠-肝”轴，导致一系列炎性因子的产生，进一步诱发和加重肝脏损伤［6-7］。益生菌是指对肠道内菌群平衡有益的活的微生态制剂，可分为多联活菌制剂和单菌制剂。益生菌可以恢复肠道微生态平衡，修复肠道黏膜屏障，提高肠道定植抗力，抑制潜在致病菌过度增长，调节全身免疫功能等达到对肝脏的保护和治疗作用［8］。2015年耶鲁∕哈佛研讨会“益生菌的应用共识意见”首次增加了益生菌在肝脏疾病中的应用，包括儿童非酒精性脂肪肝、肝性脑病和酒精性脂肪肝等［1］。本研究选用的复方嗜酸乳杆菌片为临床常用益生菌，主要包括枯草杆菌、粪链球菌、日本株嗜酸乳杆菌、中国株嗜酸乳杆菌。研究发现，给予益生菌干预后，胆汁淤积大鼠血清TBiL、DBiL、TBA、ALT 和AST 水平明显降低，与黄方等［9］研究结论一致，说明益生菌可减轻胆汁淤积性肝病的肝脏损伤，改善胆汁淤积症状，促进肝功能恢复。

肠道菌群失衡、肠道细菌和内毒素易位是胆汁淤积导致内毒素血症和多器官功能衰竭的病理过程。内毒素血症对肝脏的损伤是由一系列的氧化应激与炎症反应所造成［10］。SOD 和MDA 是机体最常见的两类氧化应激指标，SOD 是机体内重要的抗氧化酶，主要作用为清除体内多余的自由基，防止自由基发生脂质过氧化，其活力的高低代表机体清除氧自由基的能力；MDA 是过氧化反应的产物，高低可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出机体细胞受自由基攻击的严重程度［11］。本研究结果显示，与正常对照组相比，模型组MDA 含量升高，SOD 降低；给予益生菌干预后不仅可显著增强SOD 活性，并且明显降低肝脏MDA含量。提示ANIT 诱导的胆汁淤积性肝病与ANIT诱导产生的氧自由基引起的脂质过氧化损伤有关，而益生菌可减轻内毒素血症，抑制氧化应激反应，最终起到改善胆汁淤积的作用。

TLR4 属于细胞表面信号转导跨膜受体，负责先天性免疫和炎症反应，广泛表达于多种肝脏细胞如肝细胞、肝枯否细胞、肝星状细胞及肝树突状细胞等，参与介导肝脏炎症或免疫调节等复杂免疫反应，在肝脏疾病的发生发展过程中发挥重要作用［12-13］。TLR4 是激活脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，也称为内毒素）信号转导的受体，LPS 通过与TLR4 结合激活细胞内信号通路、释放各种炎症因子等引起肝损伤［14］。NF-κB 是细胞内重要的核转录因子，通过调控下游多种基因的表达参与细胞的生长发育、炎症反应、免疫调节和细胞凋亡等过程。NF-κB 信号通路受多种上游信号分子刺激而激活，TLR4 就是其中之一。TLR4 诱导NF-κB 激活转移至胞核后可促进IL-6、IL-8、IL-12、IL-1β 及TNF-α 等细胞因子释放，这些炎症因子表达过量又可正反馈作用于NF-κB，继而加重炎症反应、加重肝组织的损伤［15-16］。LI 等［17］研究发现TLR4∕NF-κB 信号通路与非酒精性脂肪肝发病及进展密切相关。本研究发现，益生菌能明显抑制胆汁淤积大鼠TLR4、NF-κB 表达，降低TNF-α、IL-6 及IL-1β 水平。提示益生菌可能通过纠正肠道菌群紊乱，减轻肠道通透性及内毒素血症，下调TLR4 表达，抑制NF-κB 激活，抑制TLR4∕NF-κB 信号通路，进而下调TNF-α、IL-1β 及IL-6 的释放，减轻肝脏炎性反应，最终发挥保护肝脏及促进肝脏功能的恢复的作用。益生菌处理的正常大鼠肝功能各指标正常，提示在此治疗剂量下，未发现益生菌有肝损伤的不良反应；TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-6及IL-1β 表达与正常对照组比较差异无统计学意义，进一步证明在健康肝脏中TLR 的表达水平较低，没有TLR4∕NF-κB 信号通路的激活，从而维持机体对内毒素的不敏感性，这与既往报道［18］一致。

综上所述，TLR4∕NF-κB 通路是肝脏组织炎症反应的关键通路，益生菌可通过抑制TLR4∕NF-κB信号通路的活化，抑制肝脏炎症瀑布级联反应的启动及氧化应激反应，从而发挥对肝内胆汁淤积性肝病的治疗作用，具有良好的安全性和耐受性。但对于益生菌作用于TLR4∕NF-κB 通路的上游调控机制，尚有待于进一步研究。