半制备-高效液相色谱法测定乳粉中维生素D2和D3含量

2022-04-08范芳芳张敏娟张利娟

中国乳业 2022年3期

李媛，范芳芳，张敏娟，张利娟，康婕

陕西省产品质量监督检验研究院，陕西西安 710048

0 引言

维生素D是一种脂溶性维生素，不易溶于水，易溶于乙醇等有机溶剂。维生素D可促进人体钙、磷吸收，皮肤细胞生长、分化及调节免疫功能，主要有维生素D2（麦角钙化醇）和维生素D3（胆钙化醇）两种活性形式。维生素D缺乏会导致人体出现佝偻病、骨质软化症，婴幼儿、孕妇、中老年等人群是缺乏维生素D的高危人群，要增加维生素D供给量到每天10 μg（相当于400 IU）[1～5]。

为此，婴幼儿配方乳粉和功能乳粉均对维生素D的含量进行了强化，准确测定乳粉中维生素D的含量则成为质量控制中的一个重要环节。目前，常用的检测方法为液相色谱-串联质谱法[6～9]和高效液相色谱法[10～12]。考虑到乳粉的基质复杂，同位素内标价格较昂贵，本文采用半制备-高效液相色谱法建立了一种乳粉中维生素D2和D3的测定方法，为日常检测分析提供借鉴。

1 试验方法

1.1 仪器与试剂

LC-20AR半制备正相高效液相色谱仪（配紫外可见光检测器）、LC-20ADXR反相高效液相色谱仪（配紫外可见光检测器），岛津（上海）实验器材有限公司；MultiVortex-12涡旋混合器，广州得泰仪器科技有限公司；WE-3水浴恒温振荡器，天津市欧诺仪器仪表有限公司；H1750R台式高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；FV64氮吹仪，广州得泰仪器科技有限公司）；Vortex-Genie 2漩涡混合器，美国SI仪器公司；UPH-Ⅲ-20T纯水机，四川优普超纯科技有限公司。

维生素D2和D3标准品（纯度99.60%），德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；无水乙醇（色谱纯）、甲醇（色谱纯），德国默克公司；正己烷（色谱纯），赛默飞世尔科技公司；抗坏血酸（分析纯）、氢氧化钾（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；试验用水均为超纯水。

1.2 标准溶液的配制

1.2.1 标准储备液

准确称取维生素D2标准品10.0 mg，用无水乙醇溶解并定容于100.00 mL棕色容量瓶，制成100.00 μg/mL维生素D2标准储备液，于-20 ℃冰箱中密封保存。准确称取维生素D3标准品10.0 mg，用无水乙醇溶解并定容于100.00 mL棕色容量瓶，制成100.00 μg/mL维生素D3标准储备液，于-20 ℃冰箱中密封保存。

1.2.2 标准中间液

准确吸取维生素D2标准储备液10.00 mL，用甲醇稀释并定容于100.00 mL棕色容量瓶，制成10.00 μg/mL维生素D2标准中间液。准确吸取维生素D3标准储备液10.00 mL，用甲醇稀释并定容于100.00 mL棕色容量瓶，制成10.00 μg/mL维生素D3标准中间液。

1.2.3 标准工作液

分别准确吸取维生素D2和D3标准中间液0.02 mL、0.04 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、1.00 mL于10.00 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释成0.02 μg/mL、0.04 μg/mL、0.10 μg/mL、0.20 μg/mL、0.40 μg/mL、1.00 μg/mL维生素D2和D3混合标准工作液。

1.3 样品前处理

1.3.1 皂化

称取2.00 g（精确至0.01 g）混合均匀的固体试样于50.00 mL具塞离心管中，加入0.40 g抗坏血酸，加入6.00 mL约40 ℃温水，涡旋混匀1.00 min。加入12.00 mL乙醇，涡旋混合30 s，再加入6.00 mL氢氧化钾溶液（50.00 g氢氧化钾加入50.00 mL水溶解），涡旋混匀30 s后放入水浴恒温振荡器中，60 ℃避光水浴振荡30.00 min（如样品组织较为紧密，可每隔5.00～10.00 min取出涡旋30 s），取出后立即用冷水冷却至室温。

1.3.2 提取

冷却后的皂化液中加入20.00 mL正己烷，涡旋提取3.00 min，在4 ℃冷冻离心机中6 000 r/min离心5.00 min，将上清液转移到另一50.00 mL离心管中，加入25.00 mL水，轻微晃动30 次，6 000 r/min冷冻离心5.00 min，取上层有机相备用。

1.3.3 浓缩

取10 mL上述有机相至10 mL氮吹管中，40 ℃水浴氮气吹干，准确加入1.00 mL正己烷，振荡溶解残渣，过0.22 μm有机滤膜，供半制备正相高效液相色谱仪进行半制备，净化待测液。

1.4 色谱条件

1.4.1 半制备正相高效液相色谱条件

色谱柱：GL SciencesInertsilSIL-100A硅胶柱，4.6 mm×250.0 mm，5 μm；流动相：环己烷+正己烷（1+1），并按体积分数0.80%加入异丙醇；流速：1 mL/min；波长：264 nm；柱温：35 ℃；进样体积：500 μL。

1.4.2 半制备净化

取维生素D2和D3混合标准系列工作液各1.00 mL于10.00 mL氮吹管中，按1.3.3步骤浓缩复溶，将标准待测液100 μL注入正相高效液相色谱仪测定，确定维生素D保留时间为18.84 min。然后将标准待测液500 μL注入正相高效液相色谱仪，并在18.00～20.00 min收集维生素D馏分于试管中，再将样品待测液500 μL按照上述步骤收集馏分于试管中，40 ℃水浴氮气吹干，准确加入1.00 mL甲醇，振荡溶解残渣，供反相高效液相色谱仪测定。

1.4.3 反相高效液相色谱参考条件

色谱柱：Omni Bond Orca C18柱，4.6 mm×250.0 mm，5 μm；流动相：甲醇；流速：1 mL/min；检测波长：264 nm；柱温：35 ℃；进样量：100 μL。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法的优化

维生素D极性较弱，且和水不相容，同时考虑到乳粉基质复杂，富含脂肪和蛋白质，所以本方法在提取过程中选用正己烷为提取溶剂，4 ℃低温冷冻离心。为减少净化过程中的损失，本方法在半制备时将配好的维生素D2和D3混合标准系列工作液各取1.00 mL，40 ℃水浴氮气吹干，加入1.00 mL正己烷溶解残渣，过0.22 μm有机滤膜后同样品溶液同步半制备净化处理。这种前处理的方法简便快速、回收率高（平均加标回收率＞90.00%），可以满足实际检测要求。

2.2 色谱条件的优化

维生素D2和D3属于固醇类衍生物，具有相同的化学性质，在正相高效液相色谱仪中无法分离，需在反相高效液相色谱仪中将其分离。因此，本方法选用了Waters XBridge C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）、Omni Bond Orca C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）、GL SciencesInertsil ODS-3 C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）三种色谱柱。结果表明，Omni Bond Orca C18柱对维生素D2和D3有较好的保留和分离效果。同时对100%甲醇、甲醇+水（95.00%+5.00%）、甲醇+乙腈（90.00%+10.00%）三种流动相进行了试验，确定100%甲醇时保留时间合适、分离效果较好。使用该优化条件的标准溶液和样品的色谱图见图1和图2。

图1 维生素D标准溶液正相反相色谱图

图2 样品中维生素D正相反相色谱图

2.3 线性范围和检出限

将半制备净化所得浓度为0.01 μg/mL、0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.20 μg/mL、0.50 μg/mL维生素D2和D3混合标准溶液注入反相高效液相色谱仪，以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线。维生素D2的线性回归方程为y=306088x - 1104.10，相关系数为0.999 6；维生素D3的线性回归方程为y=307579x - 674.92，相关系数为0.999 8。结果表明，在0.01～0.50 μg/mL范围内线性较好。当称样量为2.00 g时，以3 倍信噪比计算，维生素D2或D3的检出限为0.7 μg/100 g，定量限为2.00 μg/100 g，能满足乳粉中维生素D的分析要求。

2.4 准确度和精密度

对中国检验检疫科学研究院（中检院）和英国政府化学家实验室（LGC）乳粉中维生素D的质控样品按本方法进行检测，每个质控样测定6 次，结果如表1所示。中检院质控样特性值区间5.68～8.92 μg/100 g，LGC特性值区间6.20～16.20 μg/100 g，所有测定结果都在特性值范围内。《GB/T 27404—2008 实验室质量控制规范食品理化检测》[13]中指出被测组分含量为100 μg/kg时，相对标准偏差RSD（变异系数）应小于15.00%；真值含量为0.010～10.000 mg/kg时，测定含量平均值与真值的偏差范围应在-20.00%～+10.00%。质控样品测试结果的相对标准偏差和相对误差均满足该标准要求，本方法测量结果准确、精密度高。

表1 维生素D质控样品测定结果

2.5 实际样品检测和加标回收率

利用本方法对市场销售的5 种乳粉（婴儿配方乳粉、较大婴儿配方乳粉、幼儿配方乳粉、孕妇乳粉、中老年乳粉各1 罐）中的维生素D进行检测，并对其进行加标试验，维生素D2和D3的添加含量均为2.00 μg/100 g、4.00 μg/100 g、6.00 μg/100 g、8.00 μg/100 g、10.00 μg/100 g，样品结果和加标回收率结果如表2所示。5 种乳粉均未检出维生素D2，其加标回收率在89.50%～98.70%之间，相对标准偏差为2.33%～8.26%；维生素D3的加标回收率在88.17%～95.90%之间，相对标准偏差为2.61%～8.81%。