晏烽根 吴清 吴汶丰 刘俊峰 贾金靖 叶思祺 张瑜 莫秀梅 陈达灿

特应性皮炎(atopic dermatitis, AD)是最为常见的慢性炎症性皮肤病，AD终生患病率高达20%，瘙痒是严重影响患者生活质量的因素之一[1]。瘙痒—搔抓的恶性循环可进一步破坏皮肤屏障，加重瘙痒和皮肤炎症反应。肥大细胞在免疫球蛋白E(immunoglobulin E, IgE)介导的皮肤风团反应及其相关的AD瘙痒中至关重要，肥大细胞作为特应性皮炎的关键效应免疫细胞之一，通过增殖活化释放炎症介质或与神经系统的双向相互作用参与了特应性皮炎的病理机制及疗效作用[2-6]。基于特应性皮炎心火脾虚的中医核心病机，笔者团队总结形成了培土清心方，前期研究表明培土清心方可减轻特应性皮炎小鼠模型瘙痒症状及减少肥大细胞浸润[7-8]，然而相关作用机制尚不清楚。研究显示，肥大细胞增生与C-kit基因点突变尤其是Asp816Val(D816V)及 Val560Gly(V560G)的位点突变密切相关[9]，已广泛采用细胞株HMC1.1(V560G位点突变)与HMC1.2(D816V和V560G两个位点突变)用于开展研究[10]。故本研究通过体外实验探讨培土清心方对人肥大细胞HMC1.1突变株与HMC1.2突变株细胞增殖活性及对HMC1.1突变株相关信号通路的影响，为培土清心方治疗特应性皮炎的疗效机制提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 实验细胞及培养条件

人肥大细胞突变株HMC1.1：突变位点为C-kit蛋白中的560位点，由缬氨酸(Val)突变为甘氨酸(Gly)即：氨基酸密码子由GTC到GGC(V560G)；人肥大细胞突变株HMC1.2(560，816)：突变位点为C-kit蛋白中的Val560Gly(V560G)及816位点，由天冬氨酸(Asp)突变为缬氨酸(Val)即：氨基酸密码子由GAC到GTC(D816V)均购自美国Millipore。

细胞培养在10%胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)的IMDM培养基中。细胞培养条件为37℃，5%的CO2条件下培养。

1.2 试验药物及其制备

培土清心方已获得专利授权(专利号：ZL2013 1 0328668.4)，处方：白术10 g、连翘10 g、太子参10 g、白茅根15 g、白鲜皮10 g、山药15 g、薏苡仁10 g、甘草5 g、珍珠粉0.3 g。培土清心方的浸膏由广东省中医院广东省中医药科学院黎雄博士课题组自制(编号：20190103)，浓度为2 g/mL。复方配制为将100 mg 培土清心方浸膏溶于10 mL含10%FBS的IMDM完全培养基中，涡旋混匀后配置成10 mg/mL的培土清心方母液，过滤除菌后分装于-20 ℃保存备用。各中药单体购于成都曼思特生物科技有限公司。

1.3 主要仪器及试剂

超净工作台(ESCO公司)；水浴锅(Thermo公司)；倒置显微镜(Olympus公司，型号：CKX41)；二氧化碳培养箱(Thermo公司，型号：Thermo2838)；酶标仪(PerkinElmer公司，型号：VICTOR X5型)。

IMDM细胞培养基、FBS(Thermo公司)；2,4-二硝基甲苯(Sigma-Aldrich公司)；青霉素/链霉素双抗(Millipore公司)；蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂(Roche公司)；Phospho-C-kit(Y703)抗体、Phospho-C-kit(Y719)抗体C-kit抗体、Phospho-Stat1(Y701)抗体、Phospho-Stat3(S727)抗体、Stat1抗体、Stat3抗体(Cell signaIing technology公司)；Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)、钙离子载体A23187、地塞米松(Sigma-Aldrich 公司)；Cell Counting Kit-8试剂盒(碧云天生物技术公司)。

1.4 Cell Counting Kit-8检测培土清心方对细胞增殖活性的影响

将细胞接种于96孔板中，96孔板设立空白对照组、阴性对照组及实验组。细胞种板密度为1×104个每孔100 μL。培土清心方实验组设立不同浓度，分别为0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL，每个药物浓度设3个复孔。作用时间点分别为24小时、48小时和72小时，实验重复三次。在不同药物浓度作用各时间点后加入10 μL每孔的CCK-8试剂，再孵育4小时后，酶标仪在波长450 nm检测各孔吸光度。

1.5 蛋白免疫印迹法检测培土清心方对HMC1.1细胞C-kit/Stat信号通路的影响

取对数生长期的HMC1.1细胞接种于6 孔板，细胞密度为1.5×106个/mL，先加培土清心方各剂量处理2小时后，再加刺激剂培养24小时后弃去培养液，细胞实验刺激剂为十四烷酰佛波醇乙酸酯(PMA，0.05 μmol/L)和钙离子载体A23187(1.0 μmol/L)，细胞阳性对照药为地塞米松(Dexamethasone, DEX, 0.1 μmol/L)。收集各组HMC1.1细胞，分别加入裂解液提取总蛋白，采用BCA 法测定蛋白浓度，待测样品测定蛋白浓度后进行蛋白变性，然后取相同蛋白上样量进行SDS-PAGE电泳，然后将电泳后的蛋白湿法电转移至NC膜上。室温封闭1小时后，经目标抗体4℃孵育过夜。然后洗膜3次，每次5 分钟，加入相对应二抗(1∶ 5000)室温孵育1小时，PBST 清洗后显色液显影，利用凝胶成像仪成像。以GAPDH 抗体为内参，进行灰度值分析。 实验重复3次。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 培土清心方降低肥大细胞HMC1.1与HMC1.2细胞增殖活性

培土清心方作用于HMC1.1和HMC1.2细胞24小时，与正常对照组比较，细胞增殖活性无显著差异(P>0.05)。培土清心方0.25 mg/mL及高剂量作用于HMC1.1与HMC1.2细胞48小时后能显著抑制细胞增殖(P<0.05)，并且呈现一定的剂量依赖性。培土清心方作用HMC1.1与HMC1.2细胞72小时也呈现剂量依赖性抑制细胞增殖活性作用。尤其是对HMC1.1细胞增殖抑制更为明显，见表1、2。

2.2 培土清心方对HMC1.1细胞相关信号通路的影响

基于“2.1 培土清心方降低肥大细胞HMC1.1与HMC1.2细胞增殖活性”实验结果，得出培土清心方对HMC1.1细胞抑制作用更加明显，尤其是高剂量。因此，后期探讨培土清心方作用的机制研究将采用HMC1.1细胞进行。

培土清心方对HMC1.1细胞作用8小时后，培土清心方可降低Phospho-C-kit(Y703)蛋白表达的趋势，尤其在高剂量能明显降低该蛋白表达，比地塞米松阳性药组(DEX组)更加明显，见图1A、表3。同时，检测了培土清心方对Phospho-C-kit(Y719)蛋白的作用，与刺激组(P/A组)比较，培土清心方各剂量组具有一定量降低Phospho-C-kit(Y719)蛋白表达的作用。尤其在培土清心方高剂量组，见图1B、表4。

表3 培土清心方对Phospho-C-kit(Y703)及C-kit蛋白表达的影响

表4 培土清心方对Phospho-C-kit(Y719)及C-kit蛋白表达的影响

进一步检测了C-kit/Stat信号通路的Stat相关蛋白。培土清心方作用HMC1.1细胞8小时的时间点下，培土清心方对Phospho-Stat1(Y701)/Stat1蛋白表达具有下调趋势，尤其在培土清心方高剂量下调作用更加明显，并且呈现剂量依赖性下调作用，见图2A、表5。此外，检测了培土清心方对Phospho-Stat3(S727)及Stat3的作用，培土清心方高剂量与刺激组(P/A组)比较无明显差异，见图2B、表6。

表2 培土清心方对HMC1.2细胞增殖活性的影响

注：A：培土清心方对Phospho-C-kit(Y703)及C-kit蛋白的作用；B：培土清心方对Phospho-C-kit(Y719)及C-kit蛋白的作用。图1 培土清心方对HMC1.1细胞Phospho-C-kit及C-kit表达电泳图

注：A：培土清心方对Phospho-Stat1(Y701)及Stat1蛋白的作用；B：培土清心方对Phospho-Stat3(S727)及Stat3蛋白的作用。图2 培土清心方对HMC1.1细胞Phospho-Stat1、Stat1、Phospho-Stat3及Stat3表达电泳图

表5 培土清心方对Phospho-Stat1(Y701)及Stat1蛋白表达的影响

表6 培土清心方对Phospho-Stat3(S727)及Stat3蛋白表达的影响

3 讨论

中医药治疗特应性皮炎可发挥抗菌消炎、抗变态反应和免疫调节作用，具有一定的优势及特色[11]。培土清心方是我们团队对特应性皮炎患者的长期临床诊治，从而总结形成的经验方。处方现已获得国家知识产权局专利保护授权(专利号：ZL2013 1 0328668.4)。前期培土清心方对特应性皮炎疗效研究包括国家自然科学基金等多个课题进行了探讨。既往的研究表明其发挥了多维度、多靶点的药理作用。在临床症状改善方面，培土清心方能明显改善患者皮损严重程度[12-15]、瘙痒及睡眠[16]。且前期动物实验表明，培土清心方可缓解特应性皮炎小鼠模型瘙痒症状及减少肥大细胞浸润[7-8]。但培土清心方缓解瘙痒、减少肥大细胞浸润的机制尚不明确，对HMC1.1及HMC1.2的增殖作用及相关机制亦无探讨。

特应性皮炎也称为特应性湿疹，是一种慢性炎症性皮肤病，其主要的临床特征为反复发作的湿疹样皮损改变和剧烈瘙痒。特应性皮炎的病理机制涉及表皮屏障、皮肤微生物组异常和主要的2型炎症免疫失调之间的复杂相互作用[17]。肥大细胞与 AD发病机制密切相关，研究表明，AD 患者皮肤中存在Th2细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞浸润，肥大细胞释放多种物质，如类胰蛋白酶、组胺和白介素31(interleuk in-31,IL-31)，可与皮肤神经末梢的相应受体结合，产生瘙痒[18]。Yamashita 等[19]运用半抗原和赋形剂刺激肥大细胞缺陷 Kit Sl/Sl-d小鼠，以诱导AD模型，尽管小鼠出现表皮增厚和炎症细胞浸润的病理表现，以及IgE水平升高，但半抗原刺激的小鼠搔抓行为并未增强，这表明AD的瘙痒需要肥大细胞的参与。此外，IgE与肥大细胞上的特定受体FCεRI交联，导致肥大细胞脱粒并释放过敏性介质(组胺，前列腺素，白三烯，单核细胞趋化蛋白1，IL-6和IL-8)。这些过敏介质与TH1释放的介质相互作用，加速了AD的疾病进程[20]。抗原/IgE 介导的肥大细胞活化是一个多步骤过程,FcεRI 介导的激活事件受其他表面受体(如 KIT、腺苷受体、前列腺素受体和许多其他受体)的参与调节[21]。故本研究以人肥大细胞HMC1.1及HMC1.2为研究模型，探讨培土清心方对其增殖活性的影响，以期阐释培土清心方缓解AD瘙痒的作用机制。

肥大细胞增殖与C-kit及其配体密切相关。C-kit 基因编码跨膜受体酪氨酸激酶，C-kit基因产物在细胞生长和分化中具有重要功能。 C-kit的配体为一种新型生长因子，该因子也被称为肥大细胞生长因子，现常称为干细胞因子(Stem Cell Factor，SCF)。在人类皮肤中，肥大细胞和表皮黑色素细胞是仅有的表达 KIT 受体的细胞[22]。组织中肥大细胞数量的调节取决于从骨髓产生肥大细胞前体的速率和成熟肥大细胞在组织内的存活时间。肥大细胞在IL-3和 C-kit 配体(SCF)的影响下从骨髓发育而来。SCF 促进肥大细胞增殖可被其他细胞因子增强，如IL-4 和 IL-10[23]。SCF 与其受体 C-kit (CD117) 之间的相互作用具有酪氨酸激酶活性，可诱导细胞内信号传导，促进肥大细胞的分化、增殖、趋化和成熟。缺乏 SCF 或 C-kit 的小鼠基本也缺乏肥大细胞 ，可见C-kit与 SCF 对肥大细胞的存活和发育起着关键作用[24]。

AD患者的苔藓样病变中可观察到肥大细胞数量增加。由于 SCF 是肥大细胞最重要的有丝分裂原和化学引诱剂，SCF 与其受体C-kit的相互作用可能是 AD 病变中肥大细胞募集和增殖的重要事件。患者血清sSCF 和 sKIT 水平可能是评估AD 疾病活动度和严重程度的有用指标[25]。

本实验采用Cell Counting Kit-8检测法，研究培土清心方对肥大细胞HMC1.1与HMC1.2细胞增殖活性的影响，结果显示培土清心方显著抑制肥大细胞HMC1.1与HMC1.2细胞增殖活性，并呈剂量依赖性，其中HMC1.1的增殖活性抑制更为明显。该结果表明，培土清心方可抑制肥大细胞增殖活性，从而为培土清心方缓解AD瘙痒及减轻肥大细胞浸润提供依据。其对HMC1.1的增殖具有更强的抑制作用，可能与其V560G位点突变相关。

Kit的酪氨酸激酶活性对STAT信号激活至关重要，C-kit 的不同细胞内结构域参与了各种STAT蛋白的激活[26]。激活的 Kit可刺激MAPK、JAK-STAT和mTOR等细胞内通路。JAK2与C-kit 结合并在 SCF 刺激后磷酸化，JAK2激活导致 STAT 1α、STAT 3、STAT 5A 和STAT 5B的磷酸化[27]。其中，JAK3/STAT通路是 KIT(V560G) 的优先信号通路，而mTORC1/4E-BP1通路优先连接到 KIT(D816V)。这些关键信号通路的抑制导致程序性细胞死亡[28]。JAK-STAT信号通路在AD的病理生理机制中发挥重要作用[29]。在体外实验中，IL-9 通过激活 STAT 3 刺激人肥大细胞产生 VEGF[30]。AD 动物模型中肥大细胞 VEGF 生成和血管生成的显着增加也支持 JAK-STAT 在该免疫途径中的作用[31-32]。

如上所述，JAK3/STAT通路是 KIT(V560G) 的优先信号通路，且肥大细胞增殖与C-kit及其配体密切相关。故本研究进一步利用Western Blot 检测培土清心方给药后对HMC1.1细胞的C-kit及Stat相关蛋白表达的影响。结果表明，培土清心方作用8小时后，各剂量组具有降低Phospho-C-kit(Y703)、Phospho-C-kit(Y719)蛋白表达的趋势。故培土清心方可能通过减少C-kit蛋白的表达，从而抑制肥大细胞的增殖。此外，JAK-STAT作为其下游通路，蛋白免疫印迹法检测结果亦表明，培土清心方对Phospho-Stat1(Y701)/Stat1蛋白表达具有下调趋势，尤其在高剂量，其下调作用更加明显，并呈现一定的剂量依赖性。

综上所述，本研究利用HMC1.1及HMC1.2细胞模型，阐明培土清心方可显著抑制HMC1.1及HMC1.2细胞增殖活性。培土清心方可能通过抑制C-kit/Stat信号通路，从而降低HMC1.1细胞的增殖活性。该研究为临床应用培土清心方缓解特应性皮炎瘙痒症状提供新的理论基础和研究方向。但本文仍有一定的局限性，需要开展进一步的动物实验以验证上述结果。