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（1阿勒泰地区畜牧工作站，新疆阿勒泰 836500；2石河子大学动物科技学院，新疆石河子832003；3新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心，新疆乌鲁木齐 830000；4新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心），新疆乌鲁木齐 830000）

肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）是一种可引起人和多种动物患病的条件性致病菌。该菌主要引起人和多种动物的肺炎、呼吸道感染、肠炎、肝脓肿、腹膜炎、脑膜炎、腹泻，甚至败血症[1]。目前，国内外已从多种家畜、家禽、野生动物、水生动物体内分离到该菌[1]。近年来，关于该菌致病的报道越来越多，已经成为除大肠杆菌外最重要的条件致病菌[2]。由于滥用抗生素导致该菌耐药性不断增强，大大增加了该菌所致疾病的发生率和死亡率，给临床治疗带来严重困难，也给养殖业造成了巨大经济损失[3]。

2021年，哈密某牛场送检1份病死犊牛肺脏组织，主述患病犊牛有发热、食欲减退等症状，第2天呼吸道症状加重，后死亡，可见肺脏出现水肿和肉变区。为了明确造成犊牛死亡的主要原因，本实验室通过纯化分离、细菌通用引物扩增测序、动物试验、药敏试验分析等方法，对临床送检的病死犊牛肺脏组织中的细菌进行检测，以期为临床上肺炎克雷伯氏菌病的防治与耐药性相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

试剂及器材有：脑心浸液培养基（BHI肉汤），购自北京奥博星生物技术有限公司；DL2000核酸Marker，购自大连宝生物有限公司；革兰氏染液，购自北京索莱宝科技有限公司；90 mm细菌培养皿，购自兰杰柯科技有限公司；200 μL移液器，购自普兰德（上海）贸易有限公司；1 mL注射器，购自武汉市王冠医疗器械有限责任公司；药敏纸片，购自青岛易邦生物工程有限公司；其他还包括PCR仪、电泳仪、恒温水浴锅、微波炉、标准型单人超净工作台、恒温培养箱、压力蒸汽灭菌器、电子天平、空气浴摇床、显微镜。

1.2 病料和试验动物

试验材料有：病死犊牛肺脏组织，来自新疆哈密某牛场；健康小鼠，购买自新疆维吾尔自治区疾病预防与控制中心实验动物中心。

1.3 引物设计

参照文献，设计并合成细菌鉴定通用引物：27F5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′；1492R5′－ACGGT TACCTTGTTACGACTT－3′，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，按照说明书稀释至10 μmol/L，－20℃保存备用。

1.4 肺炎克雷伯氏菌疑似菌株的获取

在无菌条件下，取病牛部分肺脏组织划线接种于BHI培养基上，37℃培养12～24 h，再将少量病变牛肺脏组织放入BHI液体培养基中37℃振荡培养12～24 h。

1.5 革兰氏染色镜检

将BHI固体培养基和BHI肉汤均进行革兰氏染色，观察细菌的形态特征和染色特征。

1.6 小鼠致病性试验

将已培养出菌株的BHI肉汤给小鼠腹腔注射200 μL/只。同时设立感染组和空白对照组，空白组不进行处理。在小鼠死亡后采集小鼠心血加入BHI肉汤中继续培养。

1.7 16S rDNA基因鉴定

取经过纯化培养的细菌肉汤1 μL加入反应体系中进行 PCR 扩增。 模板 1 μL，ddH2O 9.5 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，Mix 12.5 μL，反应体系共25 μL。循环条件：94℃预变性 5 min；95℃变性 30 s，56℃变性30 s，72℃延伸1 min，共30个循环；72℃终延伸10 min。PCR反应结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察电泳条带后回收PCR产物，送上海生工生物公司测序。

1.8 药敏试验

将BHI肉汤中纯培养的菌液使用常规纸片扩散法进行药敏试验。

2 结果与分析

2.1 肺炎克雷伯氏菌疑似菌株的获取

在BHI培养基上形成灰白色黏液状大菌落，接种环挑取时可拉丝。

2.2 革兰氏染色镜检

通过革兰氏染色后镜检显示分离菌为革兰阴性短球杆状，如图1所示。

2.3 小鼠致病性试验

感染组小鼠腹腔注射后24 h内死亡。剖检取小鼠心血进行细菌培养，通过革兰染色镜检和16S rDNA PCR鉴定，小鼠心血培养出的细菌与病死犊牛肺脏组织中分离到的细菌相同，对照组无异常反应（图 2）。

2.4 16S rDNA基因鉴定

吸取少量病死犊牛肺脏组织培养的菌液进行PCR扩增，PCR扩增结果经1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示，扩增片段约1 500 bp，与预期的PCR扩增片段大小一致。测序结果经BLAST分析比对，该菌株16S rDNA基因部分序列与肺炎克雷伯氏菌同源性达99%，鉴定该菌为牛源肺炎克雷伯氏菌。

2.5 药敏试验

按照1.8的操作过程进行药敏试验，结果如图4显示：该菌对硫酸阿米卡星、左氧氟沙星敏感；对阿奇霉素、头孢曲松钠、替米考星注射液和乳酸环丙沙星中度敏感；对氟苯尼考、头孢拉定、盐酸林可霉素、克林霉素、硫酸庆大霉素耐药。

3 结论与讨论

本研究中分离菌株在BHI培养基上37℃培养12 h后出现湿润、圆形、可拉丝的菌落，这与李富祥等[1]的结论相似，可初步判定为肺炎克雷伯氏菌。对纯培养的分离菌进行16S rDNA鉴定，在约1 500 bp处出现明亮条带，经比对测序结果与肺炎克雷伯氏菌同源性达99%，可确定该分离菌株为肺炎克雷伯氏菌。分离菌株对硫酸阿米卡星、左氧氟沙星敏感；对阿奇霉素、头孢曲松钠、替米考星注射液和乳酸环丙沙星中度敏感；对氟苯尼考、头孢拉定、盐酸林可霉素、克林霉素、硫酸庆大霉素耐药，在临床治疗时应选用大多数敏感性较高的硫酸阿米卡星、左氧氟沙星等药物进行治疗。

近年来，克雷伯氏菌在人医临床上是仅次于大肠埃希氏菌的条件性致病菌，而且作为与医院密切相关的病原体，对于肺炎克雷伯氏菌的治疗不可避免地会使用大量抗生素，也就使该菌易变异产生各种抗生素水解酶，对于其治疗的首选药物碳青霉烯类抗生素产生广泛的耐药性[4]。Navonvenezia Shiri等[5]就肺炎克雷伯氏菌的耐药性展开研究，主要对β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、替加环素类和多粘菌素类的耐药基因进行讨论，在本试验中产生耐药的头孢拉定、硫酸庆大均属上述抗生素类型。

肺炎克雷伯氏菌为肠杆菌科克雷伯氏菌属重要成员，肺炎克雷伯氏菌属包括肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种、肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种、肺炎克雷伯氏菌硬鼻结亚种3个亚种，其中肺炎克雷伯氏菌分布最为广泛，可引发鱼[6]、梅花鹿[7]、貂[8]、兔[9]等多种动物及人的多种疾病[10]。

通过本次对病死犊牛肺脏组织的检测，确定了造成犊牛死亡的主要病原体为肺炎克雷伯氏菌。在后续的药敏试验中，也了解到本分离株的敏感药物，对后续牛场治疗有所帮助。