康丽娟，温 彬，靳丽丽

(保定市第一中心医院神经内科，河北 保定 071000)

脑血管疾病的致残率和致死率较高，其中缺血性脑损伤患者数占脑血管疾病患者数的60%以上，其发病原因为脑组织供血不足，导致大量活性氧自由基、炎症细胞因子产生，血脑屏障(BBB)通透性升高，引起脑水肿[1]。近年来，我国脑血管疾病患者数逐年增加[2]。目前，治疗缺血性脑损伤的原则为保护BBB结构、功能完整，有效缓解脑损伤[3]。左旋丁基苯酞为芹菜籽中的有效成分，能改善缺血区域脑血流量、重构缺血区域微循环，保护线粒体功能，促进脑缺血部位能量代谢，缓解神经功能损伤，目前在临床主要被用于治疗缺血性脑卒中，但其治疗脑卒中的相关作用机制尚不明确[4-5]。藏红花素主要提取自鸢尾科藏红花，具有抗炎、抗氧化和抗凋亡等作用，已有研究结果指出，藏红花素能保护创伤性脑损伤，但其作用机制尚不明确[6]。本研究旨在探讨藏红花素联合左旋丁基苯酞灌胃对缺血性脑损伤大鼠的保护作用，为临床应用提供理论依据。

1 材料

1.1 实验动物

选取健康、清洁级Wistar雄性大鼠40只，鼠龄为3周，体重220～260 g，均由华北理工大学提供，许可证号为SYXK(冀)2020-007。所有大鼠均给予常规饲养，自由饮食饮水，饲养温度为20～25 ℃，湿度设置为约50%，黑/白光照交替12 h。

1.2 仪器

BL-420E型生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)；SZ-1型组织混匀器(金坛市晶玻实验仪器厂)；Multiskan MK-3型酶标仪(芬兰Thermo公司)；RM2125型石蜡切片机(德国Leica公司)；BH-2型倒置光学显微镜(日本Olympus公司)；UV759型紫外-可见分光光度计(上海圣科仪器设备有限公司)。

1.3 药品与试剂

藏红花素(纯度≥98%)购自美国Sigma公司，批号为17304-G;左旋丁基苯酞(纯度99%)购自河北钱恩医药科技有限公司，批号为1811043;超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)的酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(购自上海晶抗生物工程有限公司，货号：JLC005-48T)。

2 方法

2.1 缺血性脑损伤模型的建立及分组

参考文献[7]，取40只大鼠建立缺血性脑损伤模型，通过阻断大鼠脑中动脉方法完成，术前12 h禁食禁水后，固定，颈部正中做切口(2 cm)，将右侧颈总动脉钝性剥离至颈外侧和颈内侧动脉分叉位置，将颈总动脉夹闭，颈外动脉结扎，选择颈外动脉残端切口，将拴线插入颈内动脉，深度距离分叉18 mm，固定后将动脉夹松开，将伤口逐层缝合并消毒。假手术组10只，只做切口不进行拴线插入。剩余30只模型大鼠分为模型组、左旋丁基苯酞组和联合组，各10只。

2.2 药物干预

左旋丁基苯酞(纯度为99%)使用植物油稀释10倍后配制溶剂，藏红花素(纯度≥98%)使用0.9%氯化钠溶液配制溶剂。左旋丁基苯酞组大鼠给予左旋丁基苯酞10 mg/kg，灌胃干预；联合组大鼠在左旋丁基苯酞组的基础上给予藏红花素40 mg/kg，腹腔注射[8]；假手术组和模型组大鼠给予等体积的0.9%氯化钠溶液干预。各组大鼠连续干预5 d，1日1次。

2.3 神经功能、BBB通透性和脑组织含水量统计

神经功能评分采用六分法进行评估[9]；BBB通透性通过伊文思蓝含量反应测定。称取大鼠右侧脑组织湿重，烘干后称取干重，脑组织含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。

2.4 脑组织病理学观察

干预5 d后，大鼠麻醉处死，提取大鼠脑组织，采用0.9%氯化钠溶液冲洗后，将黏附在其表面的异物清除干净，以干净纱布将表面水分吸干后制备切片，置于2，3，5-三苯基氯化四氮唑溶液中，染色15 min后使用0.9%氯化钠溶液冲洗干净，计算小鼠心肌梗死面积。之后切片经过二甲苯脱蜡后，梯度酒精水化，苏木精染色5 min，流水冲洗后给予伊红染色30 s，观察。

2.5 神经细胞凋亡

通过TUNEL试剂盒完成，将大鼠脑组织病理切片于显微镜下观察。凋亡指数(AI)=(阳性细胞数/细胞总数)×100%。

2.6 脑组织氧化应激相关指标检测

采用ELISA法检测SOD、CAT和MDA水平，严格根据说明书步骤进行操作。

2.7 脑组织勿动蛋白-66(Nogo-66)、勿动蛋白-66受体(NgR)和神经丝蛋白(NFP)蛋白表达检测

采用蛋白质印迹法将标本提取液，以1 000 r/min离心处理(离心半径为8 cm)后提取沉淀，滴加裂解液、反复冻融后，以120 000 r/min离心处理(离心半径为8 cm)，提取上清液，采用酶标仪检测Nogo-66、NgR和NFP蛋白浓度，保存。滴加10%的分离胶，封闭，吸干水分，给予5%的浓缩胶灌注，凝固后，将其在电泳槽中固定，加变性蛋白Marker样品5 μL，电泳干预30 min，待蛋白分离胶底，结束电泳；转膜成功后将硝酸纤维素膜在5%的脱脂奶粉中封闭固定1 h，加一抗(Nogo-66、NgR和NFP均为1∶1 000)孵育，经过震荡洗膜后加二抗(Nogo-66、NgR和NFP均为1∶10 000)，孵育，再次震荡洗膜，使用红外荧光成像系统对结果进行分析。以GAPDH为内参。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 四组大鼠神经功能、BBB通透性和脑组织含水量比较

模型组、左旋丁基苯酞组和联合组大鼠神经功能低于假手术组，BBB通透性和脑组织含水量高于假手术组；左旋丁基苯酞组、联合组大鼠神经功能高于模型组，BBB通透性和脑组织含水量低于模型组；联合组大鼠神经功能高于左旋丁基苯酞组，BBB通透性、脑组织含水量低于左旋丁基苯酞组，上述差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 四组大鼠神经功能、BBB通透性和脑组织含水量比较

3.2 四组大鼠脑组织病理学观察

假手术组大鼠大脑皮质神经细胞结构、形态正常；模型组大鼠脑组织中神经元数量减少，神经细胞排列紊乱，细胞间隙增加，细胞核固缩，细胞质着色不均，空泡改变；左旋丁基苯酞组、联合组大鼠脑组织中神经细胞结构形态排列整齐，细胞间隙、细胞核均有不同程度的改善，其中联合组改善更明显，见图1。

A.假手术组；B.模型组；C.左旋丁基苯酞组；D.联合组

3.3 四组大鼠脑组织神经细胞凋亡情况比较

模型组、左旋丁基苯酞组和联合组大鼠神经细胞凋亡数量高于假手术组[(2.80±0.58)%]；左旋丁基苯酞组、联合组大鼠神经细胞凋亡数量低于模型组[(49.25±7.15)%]；联合组大鼠神经细胞凋亡数量[(22.55±3.50)%]低于左旋丁基苯酞组[(29.90±4.15)%]，四组比较的差异有统计学意义(F=30.677，P<0.001)，见图2。

A.假手术组；B.模型组；C.左旋丁基苯酞组；D.联合组

3.4 四组大鼠脑组织氧化应激相关指标比较

模型组、左旋丁基苯酞组和联合组大鼠SOD、CAT水平低于假手术组，MDA水平高于假手术组；左旋丁基苯酞组、联合组大鼠SOD、CAT水平高于模型组，MDA水平低于模型组；联合组大鼠SOD、CAT水平高于左旋丁基苯酞组，MDA水平低于左旋丁基苯酞组，上述差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 四组大鼠脑组织氧化应激相关指标比较

3.5 四组大鼠脑组织Nogo-66、NgR和NFP蛋白表达比较

模型组、左旋丁基苯酞组和联合组大鼠NFP蛋白表达低于假手术组，Nogo-66、NgR蛋白表达高于假手术组；左旋丁基苯酞组、联合组大鼠NFP蛋白表达高于模型组，Nogo-66、NgR蛋白表达低于模型组；联合组大鼠NFP蛋白表达高于左旋丁基苯酞组，Nogo-66、NgR蛋白表达低于左旋丁基苯酞组，上述差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3、图3。

表3 四组大鼠脑组织Nogo-66、NgR和NFP蛋白表达比较

图3 各组大鼠脑组织Nogo-66、NgR和NFP蛋白表达

4 讨论

缺血性脑损伤发病机制与氧化应激有关，缺血会增加一氧化氮合成，产生大量的亚硝酸盐，伴随再灌注发生，氧自由基将基质金属酶激活后，降解胶原、层粘连蛋白，导致血管壁完整性被破坏，BBB通透性增加[10]。

研究结果指出，BBB通透性反映血源性脑水肿状况，正常生理下，伊文思蓝不能通过BBB，一旦BBB损伤，BBB通透性增加会导致伊文思蓝进入脑组织，伊文思蓝含量能有效反映BBB通透性[11]。本研究探讨了BBB通透性反应模型大鼠脑水肿状况，结果显示，藏红花素联合左旋丁基苯酞灌胃能提高缺血性脑损伤大鼠神经功能，降低BBB通透性、脑组织含水量，从而抑制大鼠脑水肿，保护大脑组织。研究结果指出，藏红花素能显著提高脑缺血再灌注损伤模型神经病学症状评分，从而对脑组织水肿有抑制作用，避免缺血一侧大脑皮层神经元病变，抑制神经元凋亡，从而保护全脑缺血再灌注损伤[12]。上述研究与本研究结果一致，藏红花素联合左旋丁基苯酞灌胃能减少缺血性脑损伤大鼠脑组织中神经细胞凋亡数量。

脑组织一旦发生血氧不足，就会产生大量的氧自由基，导致SOD、CAT还原酶过度消耗，氧自由基过剩会促进生成具有细胞毒性的MDA[13]。Du等[14]的研究结果指出，氧自由基会攻击细胞骨架，导致BBB结构被破坏，使BBB通透性提高。本研究中，藏红花素联合左旋丁基苯酞灌胃能改善模型大鼠SOD、CAT和MDA水平，从而抑制大鼠脑组织氧化应激损伤。藏红花素通过增加缺血性脑损伤大鼠脑组织中SOD、CAT活性，减少脂质过氧化物MDA产生，通过这一抗氧化作用起到神经保护作用。温彬等[15]的研究结果也指出，藏红花素作为一种天然的抗氧化剂，能有效抑制脑缺血再灌注大鼠氧化应激损伤，本研究也证实了上述观点。

Nogo-66与NgR蛋白对中枢神经系统轴突再生有明显的抑制作用，可使脑神经功能被破坏；同时，NgR能反映脑神经系统功能是否正常，表达脑神经状态[16]。NFP蛋白参与神经轴突细胞骨架构成，维持轴突正常形态、功能，能有效反映神经系统轴突损伤状况，参与神经传递内外信息、能量交换和物质运输等过程[17]。已有研究结果证实，Nogo-66、NgR和NFP蛋白水平与神经元功能有关，在神经系统发病机制、临床治疗中具有重要指导价值[18-19]。本研究结果显示，藏红花素联合左旋丁基苯酞灌胃能提高缺血性脑损伤大鼠NFP蛋白表达，降低Nogo-66、NgR蛋白表达，从而抑制神经细胞凋亡，减少大鼠脑组织水肿，促进神经功能恢复，保护缺血性脑损伤。张洋等[5]的研究结果也证实，左旋丁基苯酞灌胃联合高压氧通过改善Nogo-66、NgR和NFP蛋白表达，促进脑损伤小鼠神经功能恢复，与本研究结果一致。

本研究的局限性主要体现在未对藏红花素不同浓度进行研究，因此未确定藏红花素的最佳浓度，需要后续实验加以证实。

综上所述，藏红花素联合左旋丁基苯酞灌胃能提高缺血性脑损伤大鼠的神经功能，降低BBB通透性、脑组织含水量，减少神经细胞凋亡数量，抑制脑组织氧化应激损伤，从而起到对缺血性脑损伤的保护作用，其作用机制可能与调控Nogo-66、NgR和NFP蛋白有关。