蔡琨，杨雅楠*，李旭文，姜晟，卜亚谦，肖倩倩，朱冰清

(1. 江苏省环境监测中心，江苏 南京 210019；2. 江苏省环境科学研究院，江苏 南京 210036)

鱼类作为水生态系统中食物链的顶层生物群落，活动能力强，水体分布范围广，其在水生态系统中的分布特征和种群数量变化可以较好地反映水生态环境状况，是水生态系统中能够对水质及水生态安全与健康做出灵敏响应的重要生物要素。现有的传统鱼类群落监测方法主要包括网具捕捞、水下声呐探测、水下摄影、市场调查、渔民座谈以及根据一些物种的资源量估计其他物种的资源量等[1]。目前，科研和监测单位主要采用定点网具捕捞方法，对捕获物进行形态学鉴定，以提供鱼类组成、丰度及鱼类种群年龄结构的信息。但该方法既具有侵入性和破坏性，还需要基于分类学专业知识对标本进行形态学鉴定[2]，对监测技术人员依赖性强，监测标准化难以实行。

近年来，随着经济的迅猛发展和人口的不断增长，江苏省各流域水生态系统健康受到较大影响[3]。根据农业农村部通告，自2020年1月1日起，开始实施长江“十年禁渔”计划(洪泽湖、骆马湖等主要水体均执行该政策)，需要采用高效、经济且破坏性较小的方法来开展鱼类群落调查。

随着高通量测序技术的不断发展，分子生物学技术开始应用于水生生物监测。环境DNA(eDNA)指环境中游离的DNA分子，即生物通过细胞脱落、粪便、唾液、配子和分泌物等方式向环境中分泌的游离DNA[4]。尽管eDNA技术是一种相对较新的调查方法，但其已被证明在生物多样性和资源量监测中具有巨大的潜力[5-7]。由于eDNA监测方法具有易标准化、高通量等特性，可以通过针对不同物种的靶向监测、更大范围取样、提高分类结果分辨率等途径，提高对生物群落监测评估的准确性[8-9]。

现采用eDNA技术，对江苏省域尺度开展高密度点位的鱼类群落监测，探索了该方法应用于水生态环境监测、评估和管理的适用性、可行性和易用性，以期为流域生态状况评估工作提供支撑。

1 材料与方法

1.1 采样时间及点位设置

江苏省位于中国东部沿海，地处长江流域和淮河流域下游。根据江苏省环境监测中心生态遥感解译结果，全省水域面积约为1.73×104km2，占全省总面积的16%。江苏省水域共有长江、太湖、淮河和近岸海域4个主要流域水体[3]。于2020年4—5月，采集148个地表水监测断面的样品，覆盖全省13个设区市，按流域范围划分，淮河流域75个，太湖流域40个，长江流域33个(图1)。

1.2 样品采集及前处理

以S8245竖式水样采集器(嘉兴市远航环保教育仪器有限公司)采集水下20 cm左右的表层水，装入500 mL的Nalgene PE瓶(美国Thermo Fisher公司)后暂时存放于-4 ℃的避光冷藏箱中，8 h内运回实验室，以ROCKER 410隔膜真空泵(中国台湾洛科仪器股份有限公司)将水样过滤到0.45 μm的亲水性尼龙膜上(美国Millipore公司)，滤膜装入5 mL的离心管中，于-20 ℃保存[2]。

图1 148个地表水断面点位分布

1.3 DNA提取及聚合酶链式反应扩增

采用 DNeasy PowerWater Kit试剂盒(德国Qiagen公司)提取滤膜上富集的水样eDNA。采用鱼类生物多样性监测试剂盒(南京易基诺环保科技有限公司)扩增12S rDNA基因。聚合酶链式反应(PCR)扩增体系为50 μL：包括25 μL 混合缓冲液，3 μL 引物，2 μL DNA，20 μL去离子水。反应程序为：95 ℃预变性3 min，35个循环反应，95 ℃变性15 s，62.4 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s， 72 ℃最后延伸5 min，4 ℃保存。

PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测条带，之后用MinElute PCR Purification Kit试剂盒(德国Qiagen公司)纯化样品，用Qubit 4核酸/蛋白质定量荧光计(美国Life Technologies公司)测定纯化后的PCR产物浓度，等量混库。

1.4 高通量测序

取100～200 ng混库后的PCR纯化后产物，采用Ion Plus Fragment Library Kit建库试剂盒(美国Agilent公司)按照试剂盒使用说明进行测序文库的构建。将磁珠纯化好后的测序文库使用Agilent 2100 生物分析仪(美国Agilent公司)检测测序文库的DNA片段长度，将构建成功的测序文库稀释到100 pmol/L，最后采用Ion Torrent S5 plus测序仪(美国Life Technologies公司)进行高通量测序。

1.5 生物信息学分析

所有样品高通量测序的生物信息学分析都在Ubuntu操作环境下运行，分析过程中主要使用的程序为QIIME V1.9.0工具包和USEARCH V7软件[10]。分析步骤包括：原始序列Reads数过滤，评估测序生成的序列Reads质量，去除测序产生的低质量Reads，消除重复序列并丢弃单倍型，去除PCR扩增产生的嵌合体，所有处理后的序列参考97%的核苷酸相似性聚类到可操作分类单元(OTU)，对获得的12S rRNA的有效OTU使用网络公共数据库进行物种注释，计算生物类群的多样性指数。

1.6 数据统计分析

所有的数据统计分析，均在R语言操作平台(https://cran.r-project.org/)、Tableau 2019.4、Microsoft Excel 365和PRIMER 6.0等软件中完成。

2 结果与分析

2.1 水样eDNA物种注释结果

eDNA宏条形码检测共得到有效拼接序列3152 755条，平均序列长度为303 bp，聚类得到1 228个OTU，其中注释到脊索动物门的OTU为738个，序列数共计369 993条，分别注释到硬骨鱼纲、哺乳动物纲、鸟纲和其他，注释结果见表1。哺乳动物纲205个OTU注释到3目6科8属8种，分别为人、家猪、牛、山羊、绵羊、家犬、家猫及褐家鼠；鸟纲24个OTU注释到3目3科4属4种，分别为原鸡、绿头鸭、鸿雁及紫翅椋鸟。其中人的序列占比为哺乳动物纲的79.5%，脊索动物门的36.5%，表明人类活动与水体环境密切相关。

表1 脊索动物门OTU注释结果

2.2 鱼类种类组成及序列占比

2.2.1 种类组成

在现有eDNA样品中共检测到鱼类(硬骨鱼纲)OTU 418个，其中可准确注释到种的有168个，共注释到10目14科32属46种，仅注释到鱼类无其他分类信息的OTU共计99个。注释到鲤形目27种，序列占比达81.2%；鲈形目12种，序列占比7.43%；鲱形目1种，序列占比1.89%；鲇形目3种，序列占比0.65%；其他各目均为1种，共占比0.49%。鲤科鱼类有25种，优势明显，其他各科种类数差别不大。鱼类序列占比见图2。

图2 鱼类序列占比

按流域划分，在淮河流域监测到鱼类41种，长江流域35种，太湖流域31种。在三大流域共同检出的鱼类有24种，仅在淮河流域检出的鱼类有5种，分别为细尾蛇鮈(Saurogobiogracilicaudatus)、棒花鱼(Abbottinarivularis)、红须鱊(Acheilognathusbarbatus)和泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)，仅在长江流域检出的鱼类为阿部鲻鰕虎鱼(Mugilogobiusabei)，仅在太湖流域检出的鱼类为青鳉(Oryziaslatipes)。

按栖息水层划分，中上层鱼类(翘嘴鲌、青鳉、刀鲚等)，中下层鱼类(兴凯鱊、似鳊、团头鲂等)和底层鱼类(河川沙塘鳢、光泽黄颡鱼、高体鰟鮍等)均有检出。

按摄食类型划分，以杂食性鱼类最多(23种)，包括鲤、鲫、鳙等；肉食性鱼类次之(18种)，其中温和肉食性鱼类10种，凶猛肉食性鱼类8种，包括鳜、鲇、鲈、鲌、乌鳢等；植食性鱼类最少(5种)，包括草鱼、团头鲂、兴凯鱊、红须鱊和高体鰟鮍。

2.2.2 序列占比

不同流域的鱼类物种检出点位数与序列数占比差异明显。

(1)淮河流域序列占比>5%的物种共有4种，分别为鲤(34.19%)、鲫(25.53%)、鳙(5.69%)和兴凯鱊(5.11%)，而检出点位数>1/4(18个点位)的物种则分别为真吻鰕虎鱼(34/75)、鲤(26/75)、麦穗鱼(26/75)、大鳍鱊(25/75)、兴凯鱊(24/75)和(23/75)。

(3)太湖流域序列占比>5%的物种共有6种，分别为鲫(28.13%)、刀鲚(18.71%)、鲤(9.58%)、(8.78%)、兴凯鱊(5.75%)和鳙(5.34%)，而检出点位数≥1/4(10个点位)的物种则分别为刀鲚(10/40)、鲤(10/40)、(10/40)和真吻鰕虎鱼(10/40)。

2.3 鱼类多样性分析

从点位来看，检出10种以上鱼类的点位有23个，检出5～9种鱼类的点位有51个，检出1～4 种鱼类的点位有62个，另有12个点位未检出鱼类(eDNA测序信息以硅藻和蓝藻为主)。检出鱼类种数最多的点位是盐城市川东闸断面(24种)，其次为泰州市祥和大桥断面(18种)、再次为盐城市王港闸断面(17种)。

从点位所属的流域来看，淮河流域75个点位中有7个点位仅检出1种或未检出鱼类物种，淮河流域点位的鱼类多样性指数(Shannon-wiener指数)为0.04～3.99，种类丰富度指数(Margalef指数)为0.18～3.26，均匀度指数(Pielou指数)为0.04～1。长江流域33个点位中有6个点位仅检出1种或未检出鱼类物种，长江流域点位的鱼类多样性指数为0.03～3.5，种类丰富度指数为0.17～2.91，均匀度指数为0.03～0.81。太湖流域40个点位中有12个点位仅检出1种或未检出鱼类物种，太湖流域点位的鱼类多样性指数为0.01～3.43，种类丰富度指数为0.13～2.58，均匀度指数为0.01～0.95。三大流域各点位检出物种数与鱼类多样性指数示意见图3(a)(b)(c)。由图3可见，淮河流域的鱼类生物多样性相对较好，长江流域次之，太湖流域相对较低。

图3 三大流域各点位检出物种数与鱼类多样性指数示意

2.4 鱼类群落组成及结构多样性与历史资料的比较

江苏省地处北温带，境内河流纵横，湖泊密布，海洋和淡水鱼类资源十分丰富，据《江苏鱼类志》[11]记载，江苏淡水鱼类计105种(18科、65属)，其中鲤形目种类最多，有72种，占淡水鱼类总数的68.6%。2016—2018年，刘燕山等[12]在淮河江苏段共调查到鱼类56种(14科、42属)；2016—2017年，阎明军等[13]在长江江苏段靖江样点共监测到鱼类61种(18科、47属)，2017—2018年，在长江江苏段常熟样点共监测到鱼类41种(14科、34属)；2009—2010年，毛志刚等[14]利用拖网等网具在太湖流域共采集鱼类50种(15科、40属)；2013—2014年李其芳[15]在太湖流域57个河道样点调查到鱼类46种。在本次调查中，鲤科鱼类在三大流域的序列占比均较高，鲤、兴凯鱊、刀鲚、鳙和鲫等结果与传统调查结果相符。相比于历史记录而言，江苏省内鱼类群落的物种数在不断降低，水质污染、增殖放流、过度捕捞和江湖阻隔可能是导致鱼类多样性下降和物种组成变化的主要原因[16-17]。

3 讨论

3.1 水生态环境管理需求及传统形态学水生生物监测特点

水生态环境管理需要依靠水生生物监测评价结果来掌握水生态环境的现状及变化趋势。虽然水生生物、水生态环境的变化是非常缓慢的，但鱼类的强活动能力和生物“趋利避害”的特性，使得通过对鱼类群落的高频监测(如每月1次)来反映断面或小区域的水生态环境状况变化具有科学基础和现实意义。

基于水生态环境管理的需求，笔者认为传统形态学方法的水生生物监测存在3个方面的问题。(1)监测效率低。监测效率低源于形态学监测需要对生物样本个体逐一分类鉴定的方法原理，若要提高监测时效性，只能通过延长工作时间或增加技术人员实现，同时高专业性使得人员培养困难，导致人员工作负荷本就较大的全国环境监测系统，没有足够的技术人员来实现水生生物高频动态监控及快速响应的环境管理需求。(2)专业技能要求高。形态学分类时，技术人员需要在显微镜或解剖镜下，区分物种间十分微小的形态差异，要求技术人员具备大量的专业技能储备和长久的经验积累。(3)缺乏高效的质控手段。质控困难则会导致监测结果横向可比性较差，甚至可能存在同一实验室内监测结果误差较大的情况。相较于监测效率低的问题，高效质控手段的缺失可能是制约环境管理决策更重要的原因。

虽然形态学监测技术方法对于水生态环境管理而言存在一定的不足，但并不意味着可以舍弃该方法。经过多年的监测评价研究和监测业务开展，基于形态学方法的水生态监测工作形式已经越发成熟。以江苏为例，除积累了大量连续、宝贵的监测历史数据外，全省水生生物监测网络不断完善，监测技术人员能力水平持续提升，监测评价方法不断优化，使得水生态评价结果更加可靠。

3.2 eDNA技术在鱼类群落监测中的应用

eDNA技术最早开始于20世纪80年代，主要用于开展环境微生物研究。鱼类多样性是水生生态系统生物多样性的重要组成部分，1981年，Karr[18]首次提出了采用生物完整性指数(Index of Biological Integrity，IBI)，利用鱼类群落多样性来判定河流健康状况。2008年，Ficetola等[19]首次将eDNA用于检测美国牛蛙的入侵，该技术得以从两栖类、鱼类开始在水环境监测中广泛应用于其他类生物。目前，eDNA在鱼类监测方面的应用主要为珍稀物种的种群分布监测、入侵物种的范围追踪以及水生生物的群落结构调查等[2,20-22]。Hering等[23]提出，考虑到代表性、敏感性、精确性、可比性、成本效益和环境影响，eDNA方法非常适合鱼类生物多样性的评估。

虽然采用eDNA监测方法时，水样的采集方法、提取方法、引物可靠性和稳定性都会影响最终的鱼类多样性判断。同时由于eDNA监测技术广谱、高通量的特性，在提取DNA时，由于引物对不同类群及不同物种的偏好性或多或少存在差异，提取出的DNA序列定量结果肯定与真实的情况存在一定偏差。但总体而言，eDNA方法的偏差量是整体可控的，并且随着研究和应用的不断发展，可以从技术上不断缩小偏差，提升结果的准确性。

得益于高通量测序技术的飞速发展，eDNA监测方法的效率优势愈发明显，同时实验室分析过程类似于理化分析，重复、阳性对照、阴性对照、盲样、标样等都是理论上可行的质控手段，分析操作流程易标准化、规范化，结果准确性易评判分析，非常有希望解决形态学方法在水生生物监测中的3个突出问题。现阶段，仅仅利用eDNA方法，或eDNA方法与传统形态学方法相结合开展监测，已经可以较好地满足环境管理对水生生物监测评价提出的大范围、高频次、稳定监测的需求和目标。

3.3 eDNA技术在鱼类群落监测中的不足

采用eDNA技术监测鱼类群落结构的过程中也发现了一些问题，需要在今后的应用中不断完善。(1)eDNA监测方法的结果准确性需要通过进一步实验来验证，并与形态学方法进行对比确认。(2)采样体积偏小。由于考虑到大规模采样的便利性，采样体积选择了易于过滤的500 mL，eDNA富集程度低于相关学者科学研究时通常采集的量(1～2 L)，后续监测工作须综合考虑采样的便利性与eDNA的富集效果，选择合适的采样量或使用更高效的富集工具和方法。(3)鱼类群落的流动性变化会导致随机抽样误差，除需要加大富集量外，还需要对采样点设置多个小样方，增加不同生境条件下的样品来进行完善。(4)本土物种特征条形码序列的缺失使得监测结果必须与国际通用数据库进行比对，导致获得了序列但无法有效比对的现象，应注意完善本土鱼类序列信息库，提高监测结果的完整性。(5)以序列来估算生物量，目前尚无统一的标准，因此序列数占比及以序列数计算的相关多样性指数只能作为参考。