吴璟涵，刘鹏，张徐祥，任洪强

(污染控制与资源化研究国家重点实验室，南京大学环境学院，江苏 南京 210023)

介水传染病是由于饮用或接触受病原体污染的水而引起的一类传染病，其病原体主要包括细菌、病毒、原生动物等[1]。近年来，全球范围内介水传染病的暴发已经严重危害各国人民生命健康，据世界卫生组织报道，介水传染病每年造成220多万人死亡[1-2]。市政污水处理厂作为城市水循环的重要节点，既通过污水管网承接城市污水，又将处理后的污水排放进入自然水体，是人类致病菌(Human pathogenic bacteria，HPB)传播的重要源和汇。

以活性污泥为代表的生化处理工艺是市政污水处理厂的核心，是污水中有机质和营养盐去除的关键单元。随着高通量测序技术被广泛应用于污水和污泥细菌群落结构的解析[3]，生化处理工艺在塑造污水细菌群落结构尤其是HPB群落结构中的作用得到越来越多关注。污水中微生物种类繁多[4]，包括志贺氏菌[5]、铜绿假单胞菌[6]、沙门氏菌[7]、结核杆菌[8]、粪肠球菌[9]、鲍氏不动杆菌[10]等多种常见HPB，形成了复杂的HPB群落结构。Ye等[11]利用454焦磷酸测序技术在来自4个国家14座市政污水处理厂中污泥、进水、出水中检测到34个不同属的HPB。研究同时发现，部分HPB在生化处理前后的进水和出水样品中丰度相差较大，如弓形菌属在进水中相对丰度较高，而弧菌属在出水中相对丰度较高。Li等[12]通过宏基因组学方法在香港某污水处理厂中检测到113种HPB，其中79种在该污水处理厂首次检测出，而活性污泥工艺对HPB的总体去除率达到98%，但不同种类的HPB去除效果存在较大差异。Huang等[13]利用454焦磷酸测序技术在某污水处理厂中检测了243种潜在致病菌，活性污泥工艺显著降低了污水HPB群落的多样性。

氧化沟处理工艺是一种常见的活性污泥法变形工艺，具有工艺简单，运行灵活，管理方便，成本较低的特点，被广泛运用于中小型污水处理厂[14]，但氧化沟处理工艺对污水HPB群落组成的影响却鲜有报道[15]。现选择南京市某采用氧化沟处理工艺的城市污水处理厂为研究对象，采集2016年1— 12月份污水处理厂的进水、污泥和生化处理出水样品，基于16S rRNA基因的聚合酶链式反应(PCR)扩增和高通量测序技术，通过致病菌数据库比对的方法解析了HPB群落组成特征，并研究了生化处理过程中水质理化指标与HPB群落组成的相关性，从而有助于加深对污水处理系统HPB群落的动态变化规律的理解，为氧化沟处理工艺去除HPB提供科学支撑。

1 材料与方法

1.1 样品采集

选择南京市某城市污水处理厂为研究对象，该污水处理厂除收集生活组团的污水外，同时处理部分工业企业污水，日处理水量约为4.5万m3。该污水处理厂主体工艺采用改进型三槽式氧化沟为生化处理工艺，水力停留时间为18.3 h，污泥龄为18.1 d。于2016年1—12月，每月采集该污水处理厂进水、活性污泥与生化处理出水样品。使用无菌聚乙烯桶采集进水样品200 mL和生化处理出水样品20 L，使用50 mL无菌离心管采集活性污泥样品，并立即以1∶1(V/V)比例将污泥样品与无水乙醇混合，以固定生物质。将上述样品置于冰上并运送至实验室保存于-20 ℃冰箱。

1.2 水质理化指标测定

1.3 样品总DNA提取、PCR扩增与高通量测序

进水和生化处理出水样品分别经0.45 μm微孔滤膜过滤，以富集生物质用于总DNA提取。采用FastDNA SPIN试剂盒[安倍医疗器械贸易(上海)有限公司]提取样品总DNA，并采用NanoDrop©ND-2000超微量紫外分光光度计(美国基因有限公司)测定总DNA的浓度与纯度。

总DNA样品送至北京诺禾致源科技股份有限公司，扩增16S rRNA基因v4可变区，采用Hiseq 2500平台进行高通量测序，测序策略为PE250。

1.4 生物信息学分析

生物信息学分析采用QIIME2平台进行。首先，采用DADA2对原始测序序列降噪和去除冗余序列，得到扩增子序列变异(amplicon sequence variant, ASV)。其次，选择每个ASV代表序列，采用Blast方法比对包括128种人类致病菌16S rRNA基因全长序列的数据库，比对阈值E设置为10-3，将序列相似度超过97%的ASV鉴定为潜在HPB。最后，HPB的相对丰度和某一样品中HPB总相对丰度按照公式(1)和(2)[16]计算：

(1)

(2)

式中：Ai——某一样品中某一HPB的相对丰度；NHPB-like sequence——比对上的某HPB的序列条数；

N16S sequence——样品中微生物总序列条数；AT——某一样品中HPB的总相对丰度；n——某一样品中对应检出的HPB群落数量。

1.5 统计分析

采用R语言中vegan包进行HPB群落与水质指标的冗余分析(RDA)，并通过计算Spearman系数反映HPB群落丰度与水质指标的相关性，Spearman相关性系数绝对值|r|>0.80且P<0.05，即认为具有显著相关性。

2 结果与讨论

2.1 污水处理厂的水质理化指标

污水处理厂在2016年1—12月，进水水质呈现一定波动，但生化处理出水水质较为稳定，均符合《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB 18918—2002)中一级A排放标准，水质理化指标情况见表1。

表1 污水处理厂进水、生化处理出水水质理化指标

2.2 进水、污泥和生化处理出水中HPB检出种类数量与总相对丰度

利用基于16S rRNA基因的高通量测序技术，在所有进水、污泥和生化处理出水样品中共检测出28种HPB群落。3种样品中HPB检出种类数量与总相对丰度的年内变化见图1(a)(b)。通过与数据库中128种潜在HPB的信息对比发现，进水、生化处理出水中HPB的检出种类数量较为平稳，基本稳定在14 ～ 20种。污泥中HPB的检出种类数量变化较大，冬、春季节较少，其中1，3月最少，检出12种；夏、秋季节较多，其中9月最多，检出23种。

同时，进水和生化处理出水中HPB的总相对丰度变化不大，平均值为3%左右。而污泥中HPB的含量随季节的变化差异明显，2月污泥中HPB总相对丰度最低，为1.7%，5月最高，为15.1%。此外，污泥中HPB的总相对丰度普遍比进水、生化处理出水要高，显示出活性污泥对HPB具有一定的吸附、蓄积潜力。

图1 进水、污泥和生化处理出水中HPB检出种类数量与总相对丰度的年内变化

2.3 进水、污泥和生化处理出水中HPB群落组成

本研究共检出28种HPB，检出类型与年内相对丰度变化见图2，相对丰度值已通过对数标准化处理。其中，共有6种HPB在所有月份的进水、污泥和生化处理出水中均有检出且具有较高的相对丰度，分别是鲍氏志贺菌(Shigellaboydii)(0.01%～0.28%)、肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica)(0.05%～1.25%)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(0.15%～2.46%)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)(0.01%～0.31%)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)(0.07%～3.54%)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)(0.22%～9.80%)。这6种HPB在市政污水[17]与湖泊[18]、河流[19]等自然水体中均多有报道，是水环境中常见的HPB。

图2 进水、污泥和生化处理出水中HPB组成的年内变化

在上述6种HPB中，鲍氏志贺菌、粪肠球菌和鲍氏不动杆菌均呈现污泥中相对丰度高于进水和生化处理出水的分布特征，表明这3种HPB环境存活能力较强，具有在活性污泥中富集的潜力。肠道沙门氏菌、铜绿假单胞菌和结核分枝杆菌则在进水中相对丰度较高，经氧化沟工艺去除后，活性污泥和生化处理出水中相对丰度则均出现下降。

由图1可见，5和9月的进水与生化处理出水样品检出的HPB种类个数相同，但对比发现，2类样品中检出的HPB种类并不完全相同。首先，在5月的样品中，巴顿氏菌(Bartonellahenselae)、布鲁氏菌(Brucellasuis)、白喉杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)在进水中检出，经过氧化沟生化处理后，未在出水中检出。而产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、杰氏棒杆菌(Corynebacteriumjeikeium)、肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)只在生化处理出水样品中检出。其次，在9月的样品中，流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)在进水中检出，经过氧化沟生化处理后，未在生化处理出水中检出。而蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)只在生化处理出水中检出。2个月份中不同的HPB种类并无重合，说明不同季节进水的多变性和复杂性往往直接影响生化处理的效果以及出水中的HPB群落变化。

同时，在生化处理出水中，HPB的相对丰度还表现出一定的月份差异。粪肠球菌在4—7月，其相对丰度达到1.5% ～ 3.5%，远超出年度平均值1.0%。而某些HPB则在秋、冬季节的生化处理出水中相对丰度较高。鲍氏志贺菌在9—11月，相对丰度分别为0.08% ～ 0.13%，也高于年内其余月份的相对丰度。结核分枝杆菌则在8—10月相对丰度较高。此外，鲍氏不动杆菌在4—5月，以及8—11月出现了2个高相对丰度的时间段。

在生化处理出水中，蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、鲍氏志贺菌(Shigellaboydii)、脆弱类杆菌(Bacteroidesfragilis)、副百日咳博德特菌(Bordetellaparapertussis)等10种HPB在超过6个月的样品中检出。此外，还有5种HPB仅在少数月份的生化处理出水中检出，主要包括多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)、杰氏棒杆菌(Corynebacteriumjeikeium)等。

2.4 生化处理出水理化指标与HPB群落组成的相关性

图3 生化处理出水理化指标与HPB群落组成的冗余分析

表2 出水HPB丰度与理化指标的Spearman相关性系数

3 结论

(1)进水、生化处理出水中HPB的检出种类数量较为平稳，总相对丰度变化不大。污泥中HPB的检出种类数量变化较大，夏、秋季多于冬、春季；HPB总相对丰度随季节变化有明显差异，2月总相对丰度最低，5月最高。污泥中HPB的总相对丰度普遍高于进水、生化处理出水。

(2)进水、污泥、生化处理出水3种样品中检出的HPB具有相似性。其中，优势HPB包括鲍氏志贺菌、肠道沙门氏菌、铜绿假单胞菌、结核杆菌、粪肠球菌和鲍氏不动杆菌。