张亚丽，王 楠，高 静*，张 岗，李 铂，颜永刚

(1 陕西中医药大学 药学院，西安 712046；2 陕西中医药大学 陕西中药资源产业化省部共建协同创新中心/秦药特色资源研究与开发国家重点实验室(培育)，陕西咸阳 712083)

磷是植物生长发育的三大营养元素之一，也是磷脂和核酸的重要成分，同时参与能量转移反应、光合作用、糖和淀粉转运等过程[1]。虽然土壤中总磷含量非常高，但磷元素常常与Ca2+、Fe3+、Al3+形成难溶的磷酸盐[2]，使得植物能利用的有效磷浓度偏低，导致其常常处于一个低磷或者缺磷的状态。缺磷导致植物过多合成花青素，叶子和茎呈现轻微的紫色，叶表面积和作物分蘖减少，果树新芽和花形成率降低，叶片过早脱落从而限制植物生长[3]。为了维持正常生长发育，植物通过基因调控来应对磷元素的匮乏，其中磷转运蛋白作为磷元素跨质膜转运的直接执行者发挥重要作用。在低磷胁迫下磷转运蛋白常被诱导表达，帮助植物摄取土壤中磷元素并进行再分配，从而影响一系列代谢和发育过程，最终使得植物体内磷水平维持在一个动态平衡的状态[4]。

自第一个具有高亲和力的磷转运蛋白基因PHO84[5]从酵母(Saecharomyeescerevisiae)中分离得到后，相继在一些高等植物中鉴定出了许多具有磷转运能力的基因，如易可可等[6]在水稻(Oryzasativa)中首次克隆了一种耐磷饥饿的转录因子基因OsPTF1。磷转运蛋白依据亚细胞定位和功能的不同分为5个家族：Pht1、Pht2、Pht3、Pht4和PHO家族，其中Pht1(phosphate transporter 1)主要负责植物根系磷的吸收和体内磷的转运，是目前研究最多且最为深入的磷转运蛋白家族[7]。Pht1大多是膜整合蛋白，其大小相似，约为58 kD，含520～550个氨基酸残基。Pht1家族蛋白质序列和结构有高度相似性，GGDYPLSATIMSE为其特征性保守序列，Pht1在结构上属于MFS超家族的第9分支，该超家族可以通过化学渗透势梯度来运输糖、离子、抗生素、氨基酸等各种溶质分子，为高亲和力磷转运蛋白，在低磷或缺磷环境中一般被诱导表达而发挥重要的作用[8]。

目前，多个编码Pht1的基因已经在水稻[9]、大麦(Hordeumvulgare)[10]、拟南芥(Arabidopsisthaliana)[11]、马铃薯(Solanumtuberosum)[12]、番茄(Lycopersiconesculentum)[13]、苹果(Maluspumila)[14]等植物中得到了鉴定。其中对于拟南芥和水稻在低磷胁迫下Pht1的分子机制研究较为清楚，多数AtPht1在根和芽中表达，AtPht1;1和AtPht1;4在根与土壤接触面上的表皮、根毛细胞和根冠细胞中高度表达[15]。AtPht1;5在茎中和衰老叶组织中表达相对活跃，对磷从磷源到磷库的转运起至关重要的作用[16]。AtPht1;6在花中高度表达，AtPht1;8和AtPht1;9在磷从根到茎的运输中起作用[17]。水稻中约有13个Pht1基因家族成员(OsPht1;1—1;13)，缺磷能显著诱导OsPht1;2/1;4/1;8/1;9/1;10等的表达，OsPht1;2仅在主根和侧根的中柱中表达，主要负责转运和积累磷[18]，OsPht1;4在根、叶、舌叶、雄蕊和颖果中均有表达，主要负责向根、茎和糙米中积累磷[19]，OsPht1;1基因的表达受菌根真菌的特异性诱导，不受外界磷浓度的影响[20]。此外，有研究表明Pht1基因不仅在磷胁迫下有表达，也对干旱、盐、脱落酸(abscisic acid, ABA)、赤霉素(gibberellic acid, GA3)具有不同的响应，如在盐胁迫下，马铃薯中StPHT1;3上调表达，StPHT1;5/1;6下调表达，GA3诱导StPHT1;1/1;2表达，ABA处理后StPHT1;1/1;2/1;5都下调表达[21]；青稞中PHO1;2基因在ABA处理后上调表达[22]。

甘草为豆科多年生草本植物，主产于内蒙古、甘肃、青海等偏干旱的黄土高原地区，而这些地区降雨量少导致有效磷含量偏低[23]，往往限制了甘草的产量和品质，磷元素短缺成为甘草种植栽培中的难题之一。因此，解析甘草中磷的吸收和转运的生物学机理对提高甘草耐受胁迫有重要意义。本研究对甘草中Pht1家族成员进行鉴定，并克隆GuPht1;1/1;2/1;4/1;5基因。结合转录组数据分析GuPht1在干旱、高盐和低磷下的表达情况，并对其在低磷、盐、干旱、ABA、GA3处理后的时空表达进行分析，为阐述甘草磷转运蛋白的功能，挖掘甘草高效磷利用率基因提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与处理

2020年3月在新疆维吾尔自治区，乌鲁木齐市采集甘草成熟种子，经陕西中医药大学黄文静副教授鉴定为乌拉尔甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)。将甘草种子用30%的过氧化氢消毒30 min，于25 ℃恒温气候箱中催芽萌发，挑选生长一致的幼苗移栽于水培装置中，采用霍格兰全营养液水培法进行育苗。4周后以缺磷的霍格兰营养液配制10 μmol/L KH2PO4[24]溶液模拟低磷胁迫(Low P)，霍格兰全营养液配置15% PEG-6000、150 mmol/L NaCl、100 μmol/L ABA、100 μmol/L GA3溶液分别模拟干旱(PEG)、盐胁迫(NaCl)和ABA、GA3处理，霍格兰全营养液处理作为对照(CK)，均设置3个生物学重复，处理3、6、12、24 h后取甘草根、叶部分，蒸馏水洗净后液氮速冻，于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 方 法

1.2.1GuPht1基因家族的筛选和鉴定基于Mochida等[25]发表的甘草基因组序列，构建本地Blast数据库，从TAIR数据库(https://www.arabidopsis.org/)[26]下载拟南芥Pht1序列，以该序列作为查询序列进行Blast同源序列比对，初步获取甘草GuPht1家族成员的候选序列。运用Pfam数据库(http://pfam.xfam.org/)对所获得的候选序列成员进行保守结构域预测，去除无典型保守结构域的基因，得到GuPht1基因家族所有基因。用ExPASy中的ProtParam工具(https://web.expasy.org/protparam/)预测其蛋白质的氨基酸分子量理论等电点(pI)等理化性质[27]。用TMHMM在线工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测甘草GuPht1蛋白跨膜结构。使用在线工具Cell-PLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)对亚细胞定位预测分析[27]。

1.2.2 系统进化树的构建与氨基酸多序列比对分析从NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上下载水稻、密花豆(Spatholobussuberectus)、木豆(Cajanuscajan)的磷转运蛋白质序列，使用MEGA7.0软件通过最大似然法将甘草与拟南芥、水稻、密花豆、木豆的Pht1蛋白序列构建进化树，bootstrap值设置为1 000；用Clustal W比对功能和GeneDoc软件得到甘草和拟南芥Pht1家族蛋白的氨基酸序列多重比对结果。

1.2.3 GuPht1 Motif、三级结构与基因Scaffold定位、顺式作用元件分析使用MEME(https://meme-suite.org/ meme/tools/meme)网站分析甘草GuPht1蛋白的保守基序(Motif)[27]。通过PlantCare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)网站对GuPht1基因启动子上游4 000 bp的序列进行顺式作用元件的预测[28]。用MG2C(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)在线工具绘制Scaffold定位图。使用在线工具SWISS-MODEL(https:// swiss model.expasy.org/)进行GuPht1蛋白质三级结构预测。

1.2.4 非生物胁迫下GuPht1转录组分析以本课题组前期获得的甘草在低磷、高盐和干旱胁迫处理7 d后的茎叶、根转录组数据为基础[29]，使用RPKM法对reads count进行均一化处理，以q< 0.05、|Log2FC| >1为差异表达基因(DEGs)的筛选标准，从DEGs中筛选出GuPht1基因并对其做热图。

1.2.5 非生物胁迫及激素处理下GuPht1基因的表达分析以生物信息学方法从甘草数据库中获得GuPht1基因家族CDS序列，由上海生工生物工程股份有限公司(上海)设计并合成(表1)。RNA的提取用多糖多酚植物RNA提取试剂盒(天根，北京)，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，用NanoDrop One 核酸蛋白浓度检测仪(赛默飞)检测RNA浓度与纯度(OD260/OD280)。模板cDNA合成采用FastKing RT Kit (With gDNase)试剂盒(天根，北京)，qRT-PCR采用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)试剂盒(天根，北京)，仪器为qTOWER2.0实时PCR系统(德国)。以Actin作为内参基因[30]，反应体系为20 μL：1 μL cDNA，上、下游引物(0.3 μmol/L)各0.6 μL，10 μL SYBR，7.8 μL ddH2O。反应程序为：95 ℃预变性15 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环40次，试验重复3次。反应程序结束后对荧光值变化曲线及熔解曲线进行分析。GuPht1基因相对表达量采用2-ΔΔCT计算[31]。

表1 GuPht1s基因家族实时荧光定量PCR和克隆引物序列

1.2.6GuPht1基因克隆由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成克隆引物(表1)，以甘草叶片cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系(20 μL): cDNA 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 2 μL，2×HieffTM PCR Master Mix酶(上海翊圣)10 μL。PCR扩增程序设置为94 ℃预变性4 min，94 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min 30 s，35个循环，最后72 ℃延伸10 min。将PCR产物切胶回收后送测序，根据测序结果验证目的基因序列的正确性。

2 结果与分析

2.1 GuPht1基因鉴定及生物信息学分析

利用比对分析，经过保守结构域确认最终在甘草基因组中共鉴定得到8条甘草GuPht1蛋白的编码基因，其蛋白质理化性质见表2，氨基酸长度介于521(GuPht1;3)～570(GuPht1;8)aa之间，分子量介于57.51(GuPht1;3)～62.22(GuPht1;8) kD之间。GuPht1;1—1;7的等电点介于8.37～8.88之间，属于偏碱性蛋白，GuPht1;8的等电点为6.33，属于偏酸性蛋白。亚细胞定位和跨膜预测结果表明GuPht1都位于细胞膜上，且有12个跨膜结构。经氨基酸序列保守基序分析，共预测了8个Motif(图1)。该家族成员的Motif相对保守，各成员间Motif数量差异较少。除了GuPht1;1/1;7/1;8、AtPht1;6/1;8/1;9不具有Motif 8外，其余均含有Motif 1—8。通过Pfam数据库进行注释发现Motif 1—2、4—5编码Sugar_t结构域，Motif 7编码MFS_1结构域，Motif 3/8编码Transmembrane region结构域，Motif 6功能未知(表3)。根据注释可以发现GuPht1保守的特征序列GGDYPLSATIMSE属于Motif 1，该特征序列所编码的结构域为Sugar_t。

表3 GuPht1s的8个保守基序注释

表2 GuPht1s的蛋白理化性质和亚细胞定位

2.2 GuPht1s氨基酸序列及系统进化分析

多序列比对分析结果表明GuPht1和AtPht1的氨基酸具有高度相似性，且在GuPhtl和AtPhtl中均含有Pht1保守的特征序列GGDYPLSATIMSE(图2)。将GuPht1与拟南芥、水稻等的磷转运蛋白序列进行系统进化分析，如图3所示(线条加粗表示自展值大于95)，GuPht1;1与AtPht1;8—1;9、OsPht1;9—1;10聚为一支，GuPht1;3/1;6与AtPht1;4/1;7聚为一支，GuPht1;2/1;4/1;5与AtPht1;5聚为一支，GuPht1;2与SsPT6、GuPht1;3与SsPT2显示出较短的进化距离，GuPht1;7与OsPht1;11聚为一支。总体上GuPht1与SsPht1、CcPht1的进化距离较AtPht1、OsPht1短，说明甘草Pht1与豆科植物亲缘关系较近。

2.3 GuPht1s三级结构及基因Scaffold定位、顺式作用元件分析

用SWISS-MODEL对GuPht1蛋白进行建模，预测结果如图4，A所示，GuPht1蛋白为单体，都具有12个跨膜螺旋结构，蛋白之间具有高度相似的空间结构。Scafflod定位显示GuPht1基因在Scaffold上均匀分布(图4，B)。为分析GuPht1基因可能参与的生物学调控，对GuPht1基因的启动子前4 000 bp区域进行分析。由图5可知，GuPht1基因含有众多顺式作用元件，如启动子核心元件(TATA-box和CAAT-box)；调控植物生长发育的相关元件，如分生组织特异性元件(CAT-box、A-box)；光调节相关元件(AE-box、Box 4、GT1-motif、MER、GATA-motif)；3类激素相关元件：生长素(TGA-element)，茉莉酸甲酯(TGACG-motif)，赤霉素(P-box、TATC-box)等；2类与逆境胁迫相关元件：干旱(MBS、MYB、CCAAT-box)和低磷(W-box、PHO-like、P1BS和G-box)。其中GuPht1;6所含顺式作用元件种类最多，并且8个GuPht1基因均含有和低磷相关的元件。

2.4 非生物胁迫下GuPht1s转录组分析

转录组数据分析发现(图6)，在盐处理后茎叶中GuPht1;2/1;4/1;6基因表达上调，GuPht1;1/1;5/1;7表达下调。GuPht1;1/1;2/1;4/1;5/1;6/1;7在干旱和低磷处理后其表达量都下调，GuPht1;1/1;5/1;8在盐和干旱处理后其表达量在根中都上调。低磷胁迫下根中GuPht1;2/1;5/1;7表达量上调。在对照组的根中GuPht1;3/1;4/1;6的表达量显著较茎叶中高，GuPht1;5/1;7的表达量显著较茎叶中低。

2.5 非生物胁迫及激素处理下GuPht1s基因的表达分析

为了进一步研究GuPht1基因的功能，本研究对甘草分别进行了非生物胁迫和激素处理，GuPht1表达结果如图7、8所示。低磷处理后，GuPht1;1/1;6在根中3、6、12、24 h都显著上调表达(P<0.05)，24 h时除GuPht1;2/1;4外其余基因都显著上调表达(P<0.05)；叶中低磷处理3、6、12、24 h后GuPht1;5/1;6都显著上调表达(P<0.05)，GuPht1;3只在24 h后显著上调表达(P<0.05)，GuPht1;1/1;7只在处理3、6 h后上调表达。ABA处理后根中除GuPht1;6在24 h显著上调表达外其余基因都显著下调表达(P<0.05)；叶中GuPht1;5显著上调表达(P<0.05)，GuPht1;3显著下调表达(P<0.05)。GA3处理6、12、24 h后根中GuPht1;5显著上调表达(P<0.05)，而其余基因都下调表达或不表达；叶中GuPht1;5在处理3、6、12、24 h后都显著上调表达(P<0.05)，而GuPht1;2在3、24 h两个时间点都上调表达。PEG处理后根中没有显著上调表达的基因；叶中GuPht1;5/1;2在处理3、6、12、24 h后都显著上调表达(P<0.05)。NaCl处理后根中GuPht1;1/1;6在24 h显著上调表达(P<0.05)，GuPht1;7/1;8在3、6、12 h后都显著下调表达(P<0.05)；叶中GuPht1;5在3、6、12、24 h都显著上调表达(P<0.05)。进一步分析得，ABA、GA3、PEG处理24 h后对甘草根中GuPht1的表达影响较其他时间明显。

2.6 GuPht1s基因全长克隆

以甘草叶片cDNA为模板，利用设计的4对PCR引物对GuPht1;1/1;2/1;4/1;5进行扩增，分别获得长度为1 562、1 618、1 625和1 616 bp的片段(图9)，大小均与预期目的条带一致。纯化回收目的条带，测序结果显示成功克隆GuPht1;1/1;2/1;4/1;5基因，且分别编码522、538、540、537个氨基酸。

3 讨 论

磷是植物所必需的矿质元素，它在核酸和磷脂、能量代谢、信号转导、酶调控等过程中具有不同的生物学功能，植物通过磷转运蛋白调控植物根际磷元素摄取、体内磷元素转运，从而使得植物免受低磷胁迫的伤害[3]。本研究在甘草中鉴定出的8个GuPht1的生物信息学特征与前人研究的结果一致[32]，说明通过生信数据挖掘出的8个GuPht1基因具有可信性。甘草中的Pht1数目与其他植物相差不大，一方面说明可能在整个进化的过程中植物对于低磷胁迫的耐受性较强，另外也有可能植物为适应缺磷环境而进化出了一套和MFS超家族中其他基因共同吸收和转运磷元素的体系，例如磷转运蛋白和糖转运蛋白的相互协同作用[33]。系统发育树表明Pht1在单子叶植物和双子叶植物中的聚类没有偏好性，这说明远在单子叶植物和双子叶植物分离前，Pht1基因就已经产生[10]。大多数GuPht1蛋白和其他植物一样，与AtPht1蛋白存在对应关系，这些蛋白可能与AtPht1蛋白具有相似的功能。GuPht1;1与AtPht1;8—1;9聚在一起，表明GuPht1;1负责磷的摄取及地上部分与根之间磷的转运，并且可能与其他GuPht1互作[11]；GuPht1;2/1;4/1;5与AtPht1;5同源关系较近，说明GuPht1;2/1;4/1;5可能对无机磷从源到库的分配起一定作用[16]。

Pht1作为高亲和性磷酸盐转运蛋白的代表，大多表现根部特异或优势表达的特征，且呈现出低磷诱导表达特性[34]。研究发现拟南芥AtPht1;1—1;5[11,16]、丹参(Salviamiltiorrhiza)Smpht1、Sm1/3/5/7/11[35]及陆地棉(Gossypiumhirsutum)GhPT6/7/15/16基因[36]在磷胁迫下的根中表达量增加，证明这类基因在植物对磷的获取和吸收中起重要作用[37]。本研究结果显示GuPht1;1/1;3/1;4/1;6/1;7/1;8基因受低磷胁迫后在根中上调表达，推测这些基因参与甘草磷元素的摄入[38]。其中GuPht1;6在叶中也上调表达，说明其不仅在磷的吸收过程中起作用，还可能参与磷在体内根叶间转运的平衡调节[32]。总体分析表明，GuPht1在低磷下的时空表达模式具有差异性，说明它们是动态调控的，一方面可能是不同Pht1基因对环境中的磷浓度或缺磷时间响应不一致所导致[39]，另一方面可能由于该类基因的表达不仅受磷胁迫的影响还受菌根真菌或根瘤菌的诱导，如大豆的GmPT8—10在受菌根侵染后其表达量增加[40]。

植物在生长发育的过程中会受到各种伤害或者胁迫，顺式作用元件与反式作用因子相互作用调控基因的表达是植物抵御非生物胁迫的方法之一。MBS、MYB、W-box等顺式作用元件存在于许多植物防御基因的启动子中，这些基因对非生物胁迫做出反应以免植物受到伤害。干旱、盐等使得植物遭受渗透胁迫，MBS和MYB是ABA信号转导的结合位点，在干旱、盐等引起的渗透胁迫相关基因的表达中起到调节作用[41]。先前有研究显示AtPHO1可以对病原体、盐和冷应激作出反应[42]，AtPHT3;1和AtPHT3;2基因在盐胁迫条件下表达显著上调，过表达导致拟南芥幼苗对盐胁迫反应的敏感性增强[43]。本研究中GuPht1;1/1;5对于盐、干旱等非生物胁迫在根和叶中都有不同程度响应，这可能是因为GuPht1;1/1;5基因含有MBS和MYB元件，说明这两个基因可能在渗透胁迫中起到缓解作用。

研究表明WRKY75[44]、WRKY6[45]、WRKY42[46]、WRKY45[47]等转录因子可以直接和Pht1基因启动子上的W-box结合从而在植物磷饥饿响应过程中发挥作用，其中WRKY6和WRKY75转录因子可以参与ABA、GA3等激素协同调控Pht1基因的表达[48-49]。WRKY6可以抑制PHO1基因表达，WRKY42可以正向调控Pht1和PHO1转录，并与叶片的衰老过程有紧密联系。已有研究表明激素在生长、发育和胁迫响应中起着重要作用，拟南芥中激素对磷饥饿反应具有调控作用[50]。本研究中GuPht1;1/1;2/1;5/1;6在GA3处理后上调表达，推测这些基因对GA3的响应可能依赖于W-box元件的调控作用[34]。外源添加ABA抑制了AtPHO1、AtPHO1;H1、AtPHT1;1的表达，这与2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶ABI1有关[51]，甘草根中GuPht1;2/1;3/1;4/1;7/1;8在ABA处理后也下调表达，推测这几个基因的表达可能与涉及ABI1的ABA信号转导级联相关，而MBS和MYB作为ABA信号转导结合位点可能对这几个基因表达也起到调控作用。

综上所述，本研究首次从甘草中鉴定了8个Pht1基因，并探讨了其在甘草中的时空表达模式，GuPht1不仅只调控磷饥饿，也响应非生物胁迫和激素处理。成功克隆GuPht1;1/1;2/1;4/1;5基因，分别编码522、538、540、537个氨基酸。本实验为甘草Pht1基因的功能及其调控网络奠定了基础，也为Pht1基因克隆、功能验证等相关基因分子作用机制研究提供参考。GuPht1的表达是否受生物因素诱导，以及不同成员参与响应低磷过程的机理还有待后续接种AMF进行研究，从而进一步解析GuPht1在植物生长发育与抗逆性中的作用，并结合遗传和分子构建GuPht1过表达的甘草毛状根体系研究GuPht1基因是否对次生代谢物合成有影响。