李明月，李孟军，李国良，郭秀林，孟祥照*

(1 河北省农林科学院 生物技术与食品科学研究所，石家庄 050051；2 河北师范大学 生命科学学院，石家庄 050024； 3 石家庄市农林科学院，石家庄 050000)

高温胁迫常常引起植物细胞内蛋白的错误折叠以及活性氧(ROS)的积累，严重制约着植物的正常生长发育过程[1]。通常来讲，当植物周围环境温度升高 10～15 ℃就可形成热胁迫[2]。为了在高温胁迫下得以生存，植物进化出一套能够维持蛋白稳定以及清除细胞内过量 ROS 的分子机制，即：当植物感知高温胁迫后，热激转录因子被迅速激活并结合到下游热激蛋白(heat shock protein，Hsp)的启动子上诱导其表达，从而抑制细胞内蛋白的错误折叠，保护蛋白质的构象以确保其行使正常的生物学功能；与此同时，植物细胞内的 ROS 清除功能酶被激活，以清除细胞内过量的 ROS 从而维持细胞的内稳态[3]。研究表明，热激转录因子不仅是植物响应高温胁迫的重要调节因子，同时也参与植物对于低温、干旱以及高盐的响应过程[4]。在拟南芥中异源过表达水稻(Oryzasativa)热激转录因子OsHsfA2e能够增强植物的耐盐性[5]。水稻热激转录因子OsHsfC1b也参与植物对于盐胁迫的响应过程[6]。过表达TaHsfA2d的转基因拟南芥不仅提高了植株的耐热性，同时还增强了其耐盐和抗旱能力[7]。

自从首个植物 Hsf 基因从番茄 (Lycopersiconesculentum)基因组中克隆得到以来，越来越多的 Hsf 基因被陆续鉴定、研究[8]。已有的研究表明，拟南芥、番茄、水稻和玉米 (Zeamays)基因组中分别有 21、16、25 和 30 个 Hsf 基因，相对于上述物种，小麦基因组中的 Hsf 多达 82 个[9-13]。依据蛋白结构将 Hsf 分成 A、B 和 C 族，到目前为止，研究最为广泛的是 A 族中的 A1 和 A2 亚族[14]。在拟南芥中，Hsf 家族成员 HsfA1s 通过激活 HSR (heat stress responsive)基因从而增强植物的耐热性，与此同时，这类基因的转录水平受到环境温度的精细调控[15]。在正常温度范围内，热激蛋白 Hsp70 和 Hsp90 能够通过与 HsfA1 蛋白互作而阻止 HsfA1 的核定位，进而抑制 HsfA1 蛋白的活性，而当植物处于高温胁迫下时，就会使得 HsfA1 蛋白从热激蛋白 Hsp70 和 Hsp90 组成的复合体中解聚并穿梭进核以调控下游 HSR 基因[16-17]。

此外，周期蛋白依赖性蛋白激酶 CDC2a 能够磷酸化 Hsf1 并随后抑制其结合到下游基因启动子上[18]。在拟南芥和番茄基因组中只有1个HsfA2 亚族成员，受高温胁迫诱导表达，在植物的基础和获得性耐热过程中均发挥重要作用[19-20]。在高温胁迫过程中，热激转录因子HsfA2 基因的表达受到 HsfA1 的调控，转录后的 HsfA2 蛋白与 HsfA1 形成异源寡聚体进核调控下游基因的表达[21]。已有的研究表明，AtHsfA2 能够部分恢复athsfA1 突变体的表型，但在功能方面，AtHsfA2 更倾向于调控细胞内氧化还原状态、碳水化合物、脂类代谢途径基因的转录，对于维持高温胁迫后细胞的内稳态起到关键作用[22-24]。将玉米 A2 亚族的3个基因ZmHsf01、ZmHsf04 和ZmHsf05 异源过表达在拟南芥中，均显著地提高了转基因拟南芥的基础耐热性[25-27]。在对小麦 A2 亚族基因TaHsfA2d的研究过程中发现，异源过表达该基因后不仅提高了转基因拟南芥的耐热能力，同时还促进了种子的产量[7]。

相对于拟南芥等物种，对于小麦热激转录因子的研究起步晚，许多基因的功能还有待于挖掘。本实验室前期的研究结果表明，小麦基因组中存在 82 个 Hsf，它们随机分布在 21 条染色体上，其中 A2 亚族有18个成员，充分说明了小麦 Hsf 的复杂性[13]。在前期研究的基础上，本研究从小麦中克隆得到TaHsfA2-5 基因的完整编码序列，以期为进一步揭示TaHsfA2-5 基因的生物学功能提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料及培养本研究选取小麦半冬性耐热性小麦品种‘沧 6005’为材料(种子由河北省沧州市农业科学院惠赠)。选取籽粒饱满且大小均一的小麦种子，经由 0.1% HgCl2表面消毒后，用自来水清洗干净并置于室温下浸泡 12 h，待根长长至 1～2 cm 时，移栽到 Hoagland 营养液中，置于温度为 25 ℃、相对湿度为 50%～60%、光周期为 16 h/8 h (光照/黑暗)、光照强度为 70～100 μmol·m-2·s-1的培养室生长。

本研究使用的拟南芥野生型材料为Columbia(Col-0)生态型，由本实验室繁种后保存。选取适量拟南芥种子，经由 0.5% 的 NaClO 进行表面消毒后，以无菌水清洗 5～6 次，并均匀地铺在 MS 固体培养基上，低温春化 3 d 后置于室温下萌发。

1.2 小麦热胁迫处理选取正常生长于 Hoagland 营养液中的小麦幼苗，参照李慧聪等[28]的方法进行高温胁迫处理，分别剪取小麦的叶片、茎和根，于液氮中速冻后备用。另外，在常规种植大田试验中，分别取花期的雌蕊、雄蕊、萼片，以及 1 周龄幼胚和成熟胚，液氮速冻，用于组织表达分析。

1.3 目的基因的克隆以RNArose Reagent Systems试剂盒 (华舜生物工程公司，上海)提取植物总RNA后，按照 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒 (TaKaRa，大连) 提供的方法去除基因组DNA并反转录合成cDNA第一条链。以基因特异性引物 (F: 5′-GACATGGACCCGGTGCCGAGTC-3′; R: 5′-TGGAATGGAA-CTAGGTTGAGAGGGT-3′)对上述cDNA进行 PCR 扩增，产物回收纯化后连接至T载体 (pEasy-Blunt Simple Cloning Kit，TransGen Biotech)，经菌液 PCR 检测后选取 3 个阳性单克隆送至上海生工生物工程技术有限公司进行测序。

1.4 亚细胞定位分析将TaHsfA2-5 基因的编码区以XbaⅠ 和BamHI 双酶切体系构建在含有 CaMV35S 启动子的 pJIT1-hGFP 表达载体上，可以将 TaHsfA2-5 蛋白与 GFP 进行融合表达。实验参照李慧聪等[28]描述的方法进行， 质粒经过金粉包埋后通过基因枪将其瞬时转化到洋葱表皮细胞中，在室温下暗培养 16 h后，于激光共聚焦显微镜 (Zeiss META510)下观察荧光。

1.5 实时荧光定量 PCR(qRT-PCR) 参考 Duan 等[13]对小麦 Hsfs 的分析结果，设计TaHsfA2-5 的特异引物，以TaRP15 (表 1)作为内参基因，按照张玉杰等[29]描述的反应体系以及程序进行扩增。在组织表达模式中将根的表达量设定为 1，在热胁迫过程中将取材 0 min 的表达量设定为 1，每次实验设定 3 个生物学重复，每个生物学重复设定 3 次技术重复。数据以 Excel 进行分析并计算标准误差，同时结合 SPSS 19.0 软件分析差异显著性。

表1 小麦 TaHsfA2-5 基因的扩增以及拟南芥 HSRs定量分析引物序列

1.6 拟南芥的遗传转化及耐热性分析拟南芥遗传转化及其筛选过程均参考张玉杰等[29]的方法。将获得的目的基因TaHsfA2-5 利用XbaⅠ和SacⅠ双酶切后构建到 pCAMBIA1300 载体上，测序验证正确后提取质粒并转化农杆菌。利用蘸花法转化拟南芥野生型植株，筛选阳性苗直至获得纯合株系。选取其中的line 15_8、 line 14_32 和 line 4_3 株系用于耐热性分析。耐热性分析分为基础耐热性 (45 ℃处理1 h 后，置于 22 ℃下恢复 8 d)和获得耐热性 (37 ℃处理 1 h，22 ℃培养 2 d，46 ℃处理 50 min 后，置于 22 ℃下恢复 8 d)两部分，每次实验每个株系至少处理 30 棵幼苗，共进行 3 次独立实验。分别观察耐热处理前后的幼苗生长表型，记录并拍照，随后收集不同株系的地上莲座叶，测定叶绿素含量。

1.7 热胁迫后转基因拟南芥 HSR 基因的表达分析选取 6 个拟南芥热相关蛋白，取 5 d 龄拟南芥野生型和转基因系 Line 15_8，经基础和获得耐热性热处理后，于恢复 1 h 和 4 h 分别取样进行定量分析。以 0 h 不同处理的野生型作为对照，数值记为 1。引物序列见表 1。

2 结果与分析

2.1 小麦 TaHsfA2-5编码蛋白的序列及其亚细胞定位分析

参照 Duan 等[13]对小麦 Hsf 的分析结果，从热处理后的小麦品种‘沧 6005’ 二叶一心幼苗叶片中克隆得到热激转录因子TaHsfA2-5 的完整编码序列，共计 1 218 bp，编码 405 个氨基酸(图1)。经蛋白序列相似性比对分析发现，该基因编码的蛋白序列与大麦 HvHsfA2b 蛋白的相似性最高，达 88.07%(图2)。

为进一步分析 TaHsfA2-5 蛋白的亚细胞定位情况，构建了可以融合表达 GFP 的瞬时表达载体，通过基因枪轰击洋葱表皮细胞，并在激光共聚焦显微镜下观察荧光，实验结果表明，TaHsfA2-5 蛋白定位于细胞核(图3)。

2.2 小麦 TaHsfA2-5 的组织表达以及在热胁迫下的诱导情况

qRT-PCR分析表明，TaHsfA2-5在小麦多个组织器官中均有表达，并且在成熟的根、雄蕊、雌蕊、萼片、成熟种子以及幼胚中呈现出较高的表达水平，在幼嫩的根、茎、叶以及成熟的茎、叶中呈现较低的表达水平(图4)。

在热胁迫条件下，TaHsfA2-5 基因在小麦叶片和根部受诱导表达的程度不同。其中，小麦叶片中的TaHsfA2-5 基因更易受到热胁迫诱导而上调表达，并且在热处理 90 min 时达到最大值；而根中TaHsfA2-5 基因在热胁迫处理条件下表现出较弱的上调表达趋势，且在热处理 120 min 时达到最大值 (图5)。

2.3 小麦 TaHsfA2-5 基因在拟南芥中的耐热性分析

拟南芥 HsfA2 亚族中只有一个成员，属于热诱导型转录激活因子，在热激响应过程中会受到 AtHsfA1 家族成员的调控，并在拟南芥获得性耐热过程中发挥重要作用[20]。为进一步分析TaHsfA2-5 是否参与调控耐热过程，选取 line 15_8、 line 14_32 和 line 4_3 过表达拟南芥纯合株系，进行基础性耐热性(图6，A、B)和获得性耐热性鉴定实验(图6，C、D)。结果表明，在正常生长条件下，转基因株系与野生型的生长状况一致；在基础性和获得性耐热试验处理条件下，转基因株系相较于野生型拟南芥幼苗能够保持更好的生长状况，说明TaHsfA2-5 能够增强拟南芥植株的基础性和获得性耐热性。

同时，通过对热胁迫处理前后拟南芥地上莲座叶中叶绿素含量的测定分析 (图6，E)发现，在处理前，转基因株系莲座叶中叶绿素含量与野生型无明显差异，通过基础性和获得性耐热试验处理后，转基因株系和野生型莲座叶中叶绿素的含量均降低，但转基因株系莲座叶中叶绿素含量要明显高于野生型，以上结果进一步说明TaHsfA2-5 基因参与了调控植物的基础性以及获得性耐热过程。

2.4 异源表达小麦 TaHsfA2-5 对拟南芥热激响应基因的影响

植物中的热激转录因子会通过结合下游 HSR 基因启动子区一段保守的热激响应元件(GAAnnTTCnn GAA)来调控植物对于高温胁迫的响应[22]。

为进一步分析小麦TaHsfA2-5 对转基因拟南芥热激响应基因的影响，对拟南芥转基因材料 line15_8 和野生型(WT)进行了基础性和获得性耐热的处理，取样后检测了 6 个下游 HSR 基因的表达量。实验结果表明，无论是通过基础性还是获得性耐热的处理，异源过表达TaHsfA2-5 均能够不同程度地上调所检测的 HSR 基因的表达量，但在获得性耐热处理的情况下多数 HSR 基因的上调表达幅度明显小于基础性耐热处理(图7)。

3 讨 论

植物响应高温胁迫是一个十分复杂的过程，涉及到多种信号通路、调控网络以及细胞组分，其中热激转录因子在调控植物响应高温胁迫的过程中发挥着重要作用[30]。以往的研究结果主要是来自于模式植物拟南芥和番茄，随着测序技术的发展，越来越多作物中的热激转录因子被发现。已有的研究表明，AtHsfA2是拟南芥 A2 亚族的唯一成员，且是响应高温胁迫的关键调控因子[22-24]。普通小麦是同源六倍体物种，基因组庞大，重复序列多，Xue 等[31]在 2014 年推测小麦至少有 56 个热激转录因子，单单 HsfA2 亚族就有 9 个成员。本实验室的研究发现，小麦的热激转录因子多达 82 个，同时 HsfA2 亚族也比先前预测的多，我们共发现 18 个 HsfA2 亚族成员，且初步分析发现多数 HsfA2 亚族成员会受到高温胁迫、过氧化氢、脱落酸、水杨酸以及 PEG 的诱导[13]。相较于模式植物，小麦中 HsfA2 亚族成员的复杂性不言而喻，因此对于小麦 HsfA2 亚族成员生物学功能的解析将会极大地推动耐热性小麦的育种进程。本研究从热处理后的小麦二叶一芯幼苗叶片中克隆得到热激转录因子TaHsfA2-5 的完整编码序列，并分析了相应蛋白序列以及亚细胞定位情况，证明该基因具备HsfA2 亚族的结构特征和定位特点，暗示其作为热激转录因子具备调控下游热激响应基因表达的可能。

根据热激转录因子蛋白结构域 HR-A 与 HR-B 之间氨基酸的数量将 Hsf 划分为 A、B、C 三大类，在 A 族中 HR-A 与 HR-B 结构域之间的氨基酸数量最多，达到 21 个，其次是 C 族，有 7 个氨基酸的插入，而 B 族中没有氨基酸的插入[32]。蛋白结构的不同也决定了各族转录因子会行使不同的功能。当前的研究结果表明，A 族成员在调控植物响应基础耐热性以及获得耐热性的过程中发挥着主效作用，在高温胁迫的诱导下能够通过结合下游热激响应基因启动子上的热激元件(HSE，heat shock element)从而使得植物对于周围不利环境做出快速应答，其中 A1 亚族在花粉中的表达量较高，A2 亚族属于高温胁迫诱导型转录因子，可以在拟南芥中保持较高的表达水平[14, 23-24]。B 族和 C 族的研究报道较少，由于它们并不具有 AHA 基序，暗示这些热激转录因子并不具有激活功能[30]。很多 B 族成员也都可以受到高温胁迫的诱导，但更多的是在热响应后期发挥着负调控基因表达的作用，而 C 族成员在高温胁迫下普遍下调，通常高表达于小麦的籽粒以及根中[31, 33-34]。本研究结果显示，TaHsfA2-5 的表达在多个小麦组织中均可检测到，并且在成熟的根、雄蕊、雌蕊、萼片、成熟种子以及幼胚中呈现出较高的表达水平；同时，该基因的表达会受到高温胁迫的诱导而上调表达，与之前对于 HsfA2 亚族的描述一致。

目前的研究结果表明，不同家族的 Hsf 存在蛋白结构和生物功能的差异，即便是同一亚族的 Hsf 成员之间也行使着不一样的功能。在拟南芥中异源表达TaHsfA2e基因虽说均可提高转基因材料的基础耐热性和获得耐热性，但显然过表达TaHsfA2e基因更利于提高植物的基础耐热能力，然而，同家族的另一个成员TaHsfA2f基因更利于提高植物的获得耐热能力[29,35]。在本研究中，将TaHsfA2-5 基因转化野生型拟南芥，通过基础以及获得性耐热实验发现，无论是从表型方面观察，还是对于热胁迫后地上莲座叶中叶绿素含量的测定，均说明TaHsfA2-5 基因对于转基因拟南芥的基础以及获得性耐热能力具有不同程度的提高，但在基础性耐热过程中，转基因拟南芥表现出相较于野生型更强的耐热性，同时，多数热激蛋白的表达量也呈现出更高的表达水平。至于TaHsfA2-5 如何在不同的耐热性处理下发挥不一样的调控方式，可能与其在不同生物学过程中调控的下游基因有关。如本研究结果表明，转基因拟南芥中热激蛋白HSP70b在基础性耐热过程中上调明显，而在获得性耐热过程中，基本上未受到高温胁迫的诱导。