黄雅理，孙会敏，林 飞，赵 霞，*，汤 龙，*

(1．中国食品药品检定研究院，北京 100050；2．海关总署国际检验检疫标准与技术法规研究中心，北京 100013)

药用包装材料包括注射剂、输液剂、储血、输血材料及其在体内长期滞留的设备或替代品的包装等，由于药用包装材料绝大部分是不溶物质，可能对人体安全性危害的风险较大。其体外细胞毒性试验如何设计，目前尚无明确的技术规范或国家标准。目前，药用包装材料的生物学评价多根据《国家药包材标准》第7部分方法类药包材标准[1]进行。但该标准只颁布了包括细胞毒性检查法等7个生物学试验项目，并未规定受试物前处理的详细方法，检测单位多参考《GB/T 16886.12-2017医疗器械生物学评价》第12部分样品制备与参照样品[2]的要求进行，但可变条件多、针对性不强、检测样品不能最大限度的进行加严和加速浸提，其毒理学风险性评估受到限制。

本研究参考多个国家标准(规范)对受试物前处理的要求[3-5]，针对医疗器械和包装材料的特殊性，选择用于注射、体内滞留等对人体风险性较高的23个包装材料，用MEM培养液和水(氯化钠注射液和超纯去离子水)两种前处理方法，制备检测样品浸提液作为溶剂，配制加胎牛血清的完全培养液，经与培养细胞接触之后，确认各检测样品浸提液是否能引起细胞毒性反应。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 检测样品药用包装材料来自16个企业共23个样品，详见表1。将圆粒样品和橡胶样品剪切成≤25 mm×10 mm×5 mm；薄膜样品裁剪成25 mm×5 mm；如样品规格≤上述体积，不做剪切。用常温去离子水在2号标准筛中清洗2遍，置50℃恒温干燥箱中烘干备用。

1.1.2 培养基MEM干粉培养基，每袋93.9 g，购于美国Gibco公司。

1.1.3 浸提介质氯化钠注射液，由石家庄四药股份有限公司生产；自制超纯去离子水和MEM培养液。

1.1.4 对照品细胞毒性阴性对照品为高密度聚乙烯膜(面积25 mm×5 mm)，由中国食品药品检定研究院提供。阳性对照品为二甲基亚砜(DMSO)，分析纯，由天津市福晨化学试剂厂生产。

1.1.5 细胞株小鼠成纤维细胞L929，由中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所提供。

1.1.6 仪器及其他本研究使用的主要仪器和实验物品包括：CO2培养箱，倒置显微镜，酶标仪，分度值(d)0.001 g的电子天平，超纯水制备系统，pH计，渗透压分析仪；2G砂芯抽滤漏斗，0.22μm滤膜除菌器，96孔培养板，25 mL细胞培养瓶等。

1.1.7 实验室环境在100级洁净度的超净工作台中操作。室温20～25℃，相对湿度40%～70%。

1.2 方 法

1.2.1 细胞培养小鼠成纤维细胞L929采用含10%胎牛血清的MEM培养液(完全培养液)，置于CO2培养箱中37℃条件下培养48～72 h，取生长旺盛的细胞用于当天试验[6]。

1.2.2 检测样品培养基浸提液制备分别称取5.0 g高压灭菌后的检测样品，按0.2 g/mL计算浸提液体积，加入无血清MEM培养液至25 mL。经37℃振荡浸提24 h，其浸提液用2G砂芯抽滤漏斗滤除浸提液粗沉淀物和检测样品后，加10%胎牛血清，经0.22 μm滤膜除菌器滤除细菌后用于试验[2]。

1.2.3 检测样品水浸提液制备分别称取5.0 g检测样品，按0.2 g/mL计算浸提液体积，加氯化钠注射液或超纯去离子水至25 mL。在高压灭菌锅中121℃(压力0.105 MPa)下浸提1 h，其浸提液用2G砂芯抽滤漏斗滤除浸提液粗沉淀物和检测样品后，作为溶剂配制MEM培养基，加10%胎牛血清，经0.22μm滤膜除菌器滤除细菌后用于试验[2，7]。

1.2.4 实验分组空白对照组为不加任何物质的完全培养液。阴性对照组为高密度聚乙烯膜按3 cm2/mL制备的水浸提液(方法同1.2.3)。阳性对照组是在完全培养液中加入10%的DMSO。试验组分为MEM培养基浸提液、氯化钠注射液浸提液和超纯去离子水浸提液。

1.2.5 检测浸提液制备条件对细胞毒性反应的影响选择2个细胞毒性反应为4级的氯化钠注射液浸提液检测样品，改变浸提温度和时间，制备121℃、20 min，121℃、30 min，121℃、1 h，70℃、24 h，50℃、72 h共5个条件下的浸提液，比较细胞毒性反应大小。

1.2.6 渗透压和p H值的测定为了解不同条件下制备的浸提液渗透压和PH值变化，制备121℃、20 min，121℃、30 min，121℃、1 h，70℃、24 h，50℃、72 h共5个条件下的氯化钠注射液和超纯去离子水浸提液，用渗透压分析仪和pH计测定浓度和pH值，确定数值变化范围[5]。

1.2.7 细胞毒性试验用完全培养液将L929细胞配制成浓度为1×104个/mL的细胞悬液接种于4个96孔培养板，每孔接种100μL。置于CO2培养箱(CO2体积分数为5%)37℃静置培养24 h，细胞贴壁生长后，弃除每孔中的上层液体。设空白对照、阴性对照、阳性对照、23个MEM培养基浸提液处理组和23个氯化钠注射液浸提液处理组，每组各设6孔，每孔加入100μL完全培养液或由浸提液配制的完全培养液，置于CO2培养箱继续静置培养。

细胞接触检测样品48 h，取出96孔培养板，于倒置显微镜下观察细胞形态。每孔加入20μL质量浓度为0.5%的MTT溶液，混合均匀后，继续培养4 h，弃除每孔中的上层液体。加入150μL DMSO，于振荡器上振荡10 min，用酶标仪在570和630 nm波长下测定吸光度值。

1.2.8 统计学分析用各试验组(包括阴性对照、阳性对照)和空白对照组测出的吸光度平均值计算细胞相对增殖率(relative growth rate，RGR)不进行组间数值差异性分析。

1.2.9 结果判定与评价细胞毒性反应分级标准[6]按：RGR≥100%为0级；RGR在80%(含)～100%为1级；RGR在50%(含)～80%为2级；RGR在30%(含)～50%为3级；RGR在0(含)～30%为4级。≤1级为阴性，2级为可疑阳性，≥3级为阳性。空白对照组细胞生长良好，阴性对照组的RGR＞80%，阳性对照组的RGR＜30%，本次试验结果成立。如果RGR不在此范围，则应重新进行试验。

2 结果

2.1 3种浸提液的细胞毒性试验结果

阴性对照组的RGR＞91%，细胞毒性反应为0～1级；阳性对照组的RGR＜16%，细胞毒性反应均为4级。检测样品MEM培养基浸提液的RGR为86%～109%，细胞毒性反应为0～1级；检测样品氯化钠注射液浸提液的RGR为6%～92%，细胞毒性反应为1～4级；其中氯化钠注射液浸提液≥2级的9个检测样品用超纯去离子水浸提液复试其RGR为45%～105%，细胞毒性反应为1～3级。见表2。

2.2 改变浸提温度和时间对细胞毒性试验的影响

氯化钠注射液浸提液细胞毒性反应为4级的2个检测样品，在低于121℃、30 min条件的浸提液，其RGR为72%～94%，细胞毒性反应为1～2级；而121℃、60 min浸提液RGR为15%～40%，细胞毒性反应为3～4级。见表3。

表3 氯化钠注射液不同浸提条件对细胞毒性试验的影响

2.3 改变浸提条件对浸提液渗透压和p H值的影响

随着温度和时间的增加，浸提液的渗透压有一定升高。在121℃、60 min条件下，氯化钠注射液浸提液配制的培养液溶出值最高为534.00 mol/L，超纯去离子水浸提液配制的培养液次之为352.33 mol/L；用两种浸提介质配制的完全培养液其浓度相差181.67 mol/L。其渗透压数值增加对表2试验结果存在一定影响，而上述条件的改变对pH值影响不大，其范围在0.25～0.37之间波动。见表4、5。

表2 3种浸提液的细胞毒性试验结果

表4 双向拉伸聚酯薄膜不同浸提条件对渗透压的影响

3 讨论

小鼠成纤维细胞L929的细胞毒性试验是一种体外检测方法，与体内试验方法相比具有简便、快速、重复性好、干扰少、敏感性高、可避免伦理问题等优点[7]，已纳入国内、外生物材料临床前常规检测项目，在评价生物安全性方面发挥着重要作用。

随着现代细胞生物学与分子生物学技术的不断发展，新材料的不断涌现[8]，用于临床的药用包装材料的风险性在提高[9]。由于绝大多数药用包装材料不易溶解，用前处理方法制备浸提液，在相关标准中均未明确说明。实际工作中，同样材料进行的细胞毒性试验，由于前处理方法不得当[10]，很可能出现不同的试验结果。所用浸提介质和浸提条件应结合受试样品的特性和临床应用情况，在不改变材料物理和化学性能同时，在标准规定范围，使用能溶出物质更多的高浓度、高温度、长时间、搅拌等加严和加速浸提条件[2]，能准确评估受试样品的风险。

表5 双向拉伸聚酯薄膜不同浸提条件对p H值的影响＊

体外细胞毒性试验受外界因素影响较大，样品浸提方式及浸提介质的合理性，浸提液中浸提物质粒子大小、数量、pH值、渗透压、无菌性、稳定性、储存时间和温度的变化等存在多项不确定性，建议上述理化指标经预试验满足基本要求[11]后，再开始进行正式试验。

在本实验室条件下，小鼠成纤维细胞对23个原料样品用氯化钠注射液作为浸提介质在121℃、60 min浸提后进行检测，发现细胞毒性反应1级的14个；2级的6个；3级的1个；4级的2个。显示药品包装材料通过体外细胞毒性试验，能够发现存在毒性反应的受试样品。

用培养基浸提液作为浸提介质经37℃、24 h浸提后进行检测，发现细胞毒性反应全部是0级和1级；50℃和70℃所制备出的浸提液虽然延长了浸提时间，但溶出物质仍然有限，对浓度、渗透压比值、pH值等影响很小。证实该浸提条件不能最大限度的浸提出受试样品中的物质，容易漏判可检出阳性的医用材料，如不是对高温有影响的受试样品建议不作为首选。

用超纯去离子水作为浸提介质在121℃、60 min浸提后进行细胞毒性检测，是对溶出度较高、渗透压值增加，对试验结果存在一定影响的补充试验，前期需经过对浓度、渗透压比值、pH值以及粒子数量、大小等检测，如能符合试验要求，其结果能排除外来因素的影响，较准确发现存在毒性反应的物质。

综合以上结果，本实验在不改变检测样品物理和化学性能同时，使用最大可溶出物质的检测样品浸提液作为溶剂配制MEM培养基，发现3个检测样品的细胞毒性反应结果阳性。因此，临床如在高温、高湿、高压下灭菌使用这些样品，须进行毒理学安全性风险评估。