响应面法优化制备眼树莲总三萜软膏

2022-04-05杨莹琛杨莉段永霞叶帆王韬翔杨柳余邦良

热带农业科学 2022年1期

杨莹琛杨莉段永霞叶帆王韬翔杨柳余邦良

摘要以眼樹莲总三萜为原料，采用 Box-Behnken 响应面法优化制备眼树莲总三萜软膏，通过考察其理化性质、稳定性以及软膏中总三萜含量确定最优软膏基质的处方。在硬脂酸、丙二醇、月桂氮卓酮的用量及乳化温度单因素实验结果基础上，采用基质的外观形状、涂展性、稠度、离心稳定性进行综合性评分，利用响应面法优化，选取最优的制备工艺。结果表明，最优软膏基质制备处方为乳化温度70℃，硬脂酸26%，丙二醇7%，月桂氮卓酮3%。软膏的综合性评分可达到最优值，为 97分，并且分析测得软膏中相应的总三萜含量较高。说明响应面法优化后的眼树莲总三萜软膏制备方法可行性高，为开发制备眼树莲软膏制剂奠定基础。

关键词眼树莲;总三萜;软膏;响应面法;制备;优化

中图分类号 TS202.3 文献标识码 A DOI：10.12008/j.issn.1009-2196.2022.01.015

Optimization of Preparation of Triterpenoid Ointments from Dischidia chinensis by Using Response Surface Methodology

YANG Yingchen1 YANG Li1 DUAN Yongxia1 YE Fan1 WANG Taoxiang1 YANG Liu1，2，3，4 YU Bangliang1，2，3，4

（1. School ofPharmacy， Hainan Medical University， Haikou， Hainan 571119， China;2. Key Laboratory of Tropical Translational Medicine ofMinistryofEducation， Haikou， Hainan 571119， China;3. Hainan Provincial Key Laboratory for Research andDevelopment ofTropical Herbs， Haikou， Hainan 571119， China;4. Haikou Key Laboratory of

Li Nationality Medicine， Haikou， Hainan 571119， China）

Abstract Triterpenoids were extracted from Dischidia chinensis and used to prepare triterpenoid ointments. The physical and chemical properties and stability of the prepared ointments and the content of triterpenoids in the ointments were determined to optimize a preparation formula for a triterpenoid ointment by using Box- Behnken response surface method. Experiments with single factors： the contents of stearic acid， propylene glycol and laurocapram in the ointments and their emulsification temperature， were designed， and the appearance shape， spreading， consistency and centrifugal stability of the ointment bases were comprehensively evaluated by scoring. An optimal preparation technology was selected for the ointment by using the response surface methodology for optimization. The optimal preparation formula for the ointment base is as follows： emulsi- fication temperature 70 C， stearic acid 26%， propylene glycol 7% and laurocapram 3%. The comprehensive score of the se- lected ointment can reach the optimal value of 97， and the total triterpenoid content in the selected ointment is high. The opti- mized preparation method for the triterpenoid ointment is feasible， which lays a foundation for the development and prepara- tion of ointments from D. chinensis.

Keywords Dischidia chinensis; triterpenoids; ointment; response surface methodology; preparation; optimization

眼树莲别名瓜子金、瓜子藤等，为萝摩科眼树莲属附生藤本植物，生长在中、低海拔的山地林谷或旷地，在中国主要产于海南、广东和广西等省区[1]。眼树莲全株入药，有清肺化痰、凉血解毒之效，民间用于治疗肺燥咳痰、咳血、百日咳、小儿积食、痴疾、齐疮毒脓、跌打肿痛、毒蛇咬伤等[2]。海南黎族地区用其全草煮水熏眼，治疗眼疾[3]。霍丽妮等[4]研究显示，从眼树莲全株中得到的总酚和总黄酮具有体外抗氧化活性。本课题组成员[5-8]发现，海南产眼树莲不同提取物具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤活性。前人的研究[9-10]得知，眼树莲药材中的有效活性成分大部分为萜类化合物。曾慧慧等[9]获得三萜类化合物的较优提取方法，目前尚未有眼树莲萜类开发成软膏的研究报道。

通过油脂性、乳剂型、水溶性软膏常用基质对比的实验，发现乳剂型基质有良好的药物释放能力，且促进药物协同作用的产生，显著提升了药物活性成分的生物利用度[11]。研究发现， O/W 型乳剂基质的药物释放速度、渗透进入皮肤的能力要优于 W/O 型[12]，因此 O/W 型将作为试验软膏的基质类型。本实验通过单因素和响应面法考察了软膏的月桂氮卓酮，丙二醇，硬脂酸，乳化温度这4 种因素对软膏综合性评分的影响，期望筛选出眼树莲软膏的最优处方，并测定眼树莲软膏总三萜的含量，验证其软膏剂的抗炎效果，为眼树莲总三萜为主药开发成软膏剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材和试剂新鲜眼树莲药材于2020年 8月采自海南省海口市秀英区，经海南大学刘寿柏副教授鉴定，其为萝摩科植物眼树莲，编号为 YSL-202008;液体石蜡、硬脂酸、羊毛脂、尼泊金乙酯、月桂氮卓酮、丙二醇、三乙醇胺均為分析纯，广西西陇化工试剂有限公司;齐墩果酸，分析标准品≥98.7%（上海阿拉丁有限公司）。

1.1.2 仪器 KQ5200DB 超声波清洗机（江苏省昆山市超声仪器有限公司）; ME204E 电子分析天平（梅特勒-托利多上海仪器有限公司）; TG16-WS 台式高速离心机（湖南湘仪实验仪器开发有限公司）; HH-420数显恒温水浴箱（上海力辰邦西仪器科技有限公司）; DFY-1000D 药用粉碎机（温岭市林大机械有限公司）;722N 可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）; Exceed-Ad-60超纯水机（成都唐氏康宁科技发展有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 样品提取物的制备制备方法同曾慧慧等[9]。制得总三萜含量为22.12 mg/g 的眼树莲提取液。

1.2.2 眼树莲软膏基质的制备通过预实验，明确眼树莲软膏制备工艺：将液体石蜡（31.3%，质量比，下同）、硬脂酸（23%～32%）、羊毛脂（5%）混合后加热至相应的温度，作为油相;将丙二醇（3%～9%）、尼泊金乙酯（0.05%）、三乙醇胺（2.5%）、月桂氮卓酮（1%～7%）、眼树莲提取液（0.3%）及水置于相同温度共同水浴，作为水相;控制搅拌速度不变，缓慢地将油相转移入水相，在较快的搅拌速度下使软膏剂基质达到均一，放置适当的温度（50～80℃）中进行水浴加热，同等转速下持续搅拌15 min 至冷凝，即制备得到软膏基质;继续搅拌15 min 至冷凝，最后分装即得规格为50 g 的眼树莲软膏。

1.2.3 软膏考察指标与评分标准参照2020 版《中国药典》[13]，以软膏基质外观性状、离心稳定性、延展性、黏度与稠度作为软膏剂的考察指标，各指标评分之和即为软膏的综合性评分，总分为100分。综合评分总分为100分，其中外观形状，涂展性，稠度各占20 分，离心稳定性占40分。评分标准[14-15]见表1。

1.2.4 单因素实验以月桂氮卓酮（质量比）、乳化温度、丙二醇（质量比）、硬脂酸（质量比）进行单因素实验，考察它们对软膏综合性评分的影响。单因素实验设置4 个实验组，每个实验组按

1.2.2的方法制得眼树莲软膏基质3 份，按照1.2.3 的方法测定眼树莲软膏综合性评分，并求其平均。初定乳化温度为50℃，丙二醇为3%，硬脂酸为23%的条件下，分别考察月桂氮卓酮（1%、3%、 5%、7%）的影响。然后依据实验所确定月桂氮卓酮的量，考察乳化温度变化（50℃～80℃）的影响;采取相同的方式确定最佳的乳化温度后，继续考察不同的丙二醇（3%、5%、7%、9%）的影响及不同硬脂酸（23%、26%、29%、32%）影响[16]。

1.2.5 响应面方法优化实验设计基于单因素实验结果，用 Design Expert 11.0 软件，根据 Box-Behnken 模型原理，筛选出4 个对软膏剂综合性评分产生显著效果的因素，即乳化温度（ A ）、硬脂酸（ B ）、丙二醇（ C ）、月桂氮卓酮（ D ）作为自变量，综合评分（ Y ）作为因变量，建立模型优化软膏制法工艺，筛选出最佳软膏基质制备条件，响应面优化实验因素和水平见表2。

1.2.6 齐墩果酸标准曲线的绘制根据文献[8，17-18]中的方法，用电子天平准确称取齐墩果酸25.0 mg，用无水乙醇加以溶解，配得齐墩果酸溶液，其浓度为5 mg/mL;量取0.4 mL 齐墩果酸溶液，置于10 mL 的试管中，80℃水浴加热至溶剂挥发完毕，加入5%香草醛-冰乙酸溶液0.6 mL ，加入高氯酸1.4 mL，混合均匀;80℃水浴加热，时间约15 min，迅速置于冰水中冷却15 min，用8 mL 乙酸乙酯进行反应，充分搅拌均匀，即得齐墩果酸标准溶液;对齐墩果酸标准溶液进行等比稀释，最终得到浓度为0.00、0.01、0.02、0.05、0.10、0.15 mg/mL 的系列标准溶液;将1 号管作为参比，在 550 nm 波长范围下，扫描得到每一试样溶液的吸光度。以系列齐墩果酸溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性方程及相关系数。

1.2.7 供试品溶液的制备将响应面优化后的实验条件制得眼树莲总三萜软膏50 g，用乙醇将其萃取，配制成0.02 g/mL 的溶液，取上清液用0.22μm 针头滤器过滤，得供试品溶液。

1.2.8 计算眼树莲总三萜软膏中总三萜得率将1.2.7中制得的供试品溶液放在试管中，用 80℃水浴加热至溶剂挥发完毕，在 1.2.6中方法下测定其吸光度，记录其吸光度，根据以下公式，计算眼树莲总三萜化合物的含量[18]。

总三萜的含量= m × c ×100%，式中： m 为根据标准曲线所得的齐墩果酸量（ mg ）;c 为稀释倍数; M 为样品中理论含有的总三萜质量（ mg ）。1.2.9 抗炎活性实验以响应面优化结果制成一组眼树莲总三萜软膏，用参考文献[5]的1.2.3 中“二甲苯所致小鼠耳肿胀抗炎模型”方法，考察其总三萜的抗炎活性。取40只雄性昆明种小鼠，分 4组，每组各10只;以 48 mg/kg 剂量灌胃用眼树莲总三萜，作为灌胃药物组;以 48 mg/kg 剂量外用眼树莲总三萜软膏，作为外用药物组;以1%的羧甲基纤维素水溶液作为空白对照组;以500 mg/kg 剂量灌胃阿司匹林，作为阳性药物组。参照杨柳等[5]的方法，计算总三萜的耳肿胀抑制率。

1.2.10 数据统计分析 Origin 8.5作图， SPSS 19.0软件对实验数据进行统计分析，设置p<0.05有显著性差异，具有统计学意义，采用 Design-Expert 11.0进行响应面优化设计。

2 结果与分析

2.1 单因素实验考察基质组成及比例

2.1.1 不同月桂氮卓酮添加量对软膏综合性评分的影响月桂氮卓酮能够加强软膏的透皮吸收，实现很好的促透作用，和丙二醇联合使用能够提高其促透作用[19]。本实验考察了1.0%、3.0%、5.0%、7.0%不同比例的月桂氮卓酮，其他條件保持不变，月桂氮卓酮的添加比例依次得到软膏综合性评分分别为76，92，85，82分。实验结果可得，随着月桂氮卓酮的增加，基质中的液体石蜡和凡士林阻止其分配进入角质层，限制了其促透作用[19]，使软膏的综合性评分降低，因此选定月桂氮卓酮为3.0%～7.0%作为进一步条件筛选的范围。

2.1.2 不同乳化温度对软膏综合性评分的影响选取乳化温度为50、60、70、80℃进行筛选，其他条件保持不变，乳化温度提高依次得到软膏综合性评分分别为75、85、95、88分。实验结果可得，当乳化温度增加时，软膏的油相和水相在水浴中溶解更完全，制备的膏体基质均匀性更好。如果温度较低，制成的膏体会出现不稳定的现象，水油分离，涂布能力较差。故拟定于60～80℃进行筛选。 2.1.3 不同丙二醇添加量对软膏综合性评分的影响选取丙二醇添加量为3.0%、5.0%、7.0%、9.0% 不同比例进行筛选，其他条件保持不变，丙二醇添加量提高得到软膏综合性评分分别为75、90、 95、85分。实验结果可得，当丙二醇含量过小，膏体稠度过大、涂布性较差，软膏综合性评分较低。由于丙二醇是水溶性保湿剂，保湿微粒较小，量过少不会起到保湿作用，又会影响乳膏的性状，因此选定在5.0%～9.0%进一步筛选。

2.1.4 不同硬脂酸添加量对软膏综合性评分的影响选取硬脂酸添加量为23%、26%、29%、32% 不同比例进行筛选，其他条件保持不变，硬脂酸添加量提高得到软膏综合性评分分别为84、88、 92、80分。实验结果可得，当硬脂酸越多时，膏体涂布性和延展性变差、稠度过大，稳定性下降，软膏的综合性评分减小。硬脂酸在乳膏剂中一般是乳化油状物，硬脂酸薄膜将随着水分蒸发产生，对皮肤起到保护效果，但含量过高会使乳膏变硬，润滑作用小，量不宜过多[20]。因此选定23%～29% 进一步筛选。

2.2 响应面方法优化实验结果

基于单因素实验结果，运用响应面法优化眼树莲软膏的基质制备工艺，获得随机实验方案及实验数据见表3。运用响应面软件回归分析，获得以乳化温度（ A ）、硬脂酸（ B ）、丙二醇（ C ）、月桂氮卓酮（ D ）为因素水平，以眼树莲总三萜软膏综合性评分为评价指标（ Y）的二次多项回归方程式：

Y=97.40‒4.42A‒4.17B‒0.17C+3.42D+0.50AB+

9.25AC+2.50AD‒0.50BC++3.00BD+3.25CD‒14.82 A2‒6.95B2‒8.20C2+3.17D2。

该模型p<0.0001，表明建立的模型显著性明显，失拟项检验p=0.092 6>0.05不显著，表明该回归模型能够较好地拟合实际情况，可以借此模型来预判实际情况，见表4。用决定系数 R2和调整决定系数 R2Adj 判断模型是否拟合[21]。R2=0.988 5、R2Adj=0.9770，数值大小相近，说明该模型完美拟合实际情况，数据较为准确可靠，代表性好，能准确预测实际情况，体现出实验值与预测值之间存在着较高的关联性[22]，因此，可以利用该模型预测眼树莲软膏的最佳制备工艺;在独立因素、因素与因素的交互作用及因素的平方项中， A、B、 D 、AC 、A²、B²、C²对眼树莲总三萜软膏综合性评分影响极其显著（p<0.0001 ），AB 、BC、D2对眼树莲总三萜软膏综合性评分影响显著（ p< 0.05），这些因素对眼树莲总三萜软膏综合性评分影响较大，说明实验数值具有统计学意义。因此，判断实验中所考察的4 个因素对综合性评分的作用并不只呈现线性关系，其交互项、二次项同样对软膏的综合性评分有着一定程度的影响。 F 值体现了各因素对软膏综合性评分的影响程度， F 值与其对响应值（综合性评分）的影响程度成正比，即说明该因素影响程度更大[23]。经表3 的数据分析可知，实验考察的4 个因素对眼树莲总三萜软膏综合性评分影响程度大小的顺序为乳化温度（ A ）>硬脂酸（ B ）>月桂氮卓酮（ D ）>丙二醇（ C ）。

2.3 响应面交互作用及条件优化

等高线图和响应面图可以形象地反映出响应值随各相关因素变化所呈现的趋势。运用响应面软件进行分析，绘制出乳化温度、硬脂酸、丙二醇、月桂氮卓酮这4 个因素之间的交互作用对眼树莲总三萜软膏综合评分影响的响应面，可以得到该模型的等高线图和响应面图。从响应面的曲面曲线来判断，曲线走势越陡，表示相应的两因素的交互作用越显著[24]，对响应值的影响也越大，当响应面分析图为山谷形曲面时，特征值均为正值，有极小值存在;当响应面图呈现山丘状的曲面时，则所对应的特征值应为负值，说明模型存在极大值;当响应面图呈现马鞍形的曲面时，则所对应的特征值有正有负，说明模型无极值[25]。若等高线图曲线形状为椭圆形，则对应两因素的交互作用显著，倘若曲线形状为圆形，则交互作用不显著，没有统计学意义。分析不同因素间的等高线图和响应面图的差异，可以直观形象地判断出两因素之间的交互作用以及交互作用的强弱，并且能够看出对响应值的影响程度。

2.3.1 乳化温度（ A ）与硬脂酸（B ）交互作用从图1 可知，乳化温度（ A ）与硬脂酸（ B ）的等高线图呈椭圆形，响应面成山丘形，并且响应面的曲面曲线走势较缓，说明这两种因素的交互作用对软膏的综合性评分的影响较为显著。由曲线可知，随着乳化温度（ A ）和硬脂酸（ B ）的增加，软膏的综合性评分也不断缓慢增加，直至达到极值。到达极值之后，综合性评分逐渐下降，表明乳化温度（ A ）与硬脂酸（B ）交互作用较为显著，响应值有极大值存在。

2.3.2 乳化温度（ A ）与丙二醇（C ）交互作用从图 2可知，乳化温度（ A ）与丙二醇（ C ）的等高线图呈椭圆形，响应面成山丘形，并且响应面的曲面曲线走势较陡，说明这两种因素的交互作用对软膏的综合性评分的影响显著。由响应面曲线走势可知，随着乳化温度（ A ）和丙二醇（ C ）的增加，软膏的综合性评分也不断增加，直至达到极值。到达极值之后，综合性评分骤然下降，表明乳化温度（ A ）与丙二醇（ C ）交互作用极为显著，响应值有极大值存在。

2.3.3 硬脂酸（ B ）与丙二醇（ C ）交互作用从图 3可知，硬脂酸（ B ）与丙二醇（ C ）的等高线曲线形状趋向近圆形，说明2 个因素间的交互作用对眼树莲软膏的综合性评分影响不显著[26]。观察响应面图形曲线得出，随着硬脂酸和丙二醇的增加，软膏的综合性评分也不断缓慢增加，直至达到极值。由于等高线图成近圆形，所以 BC 交互作用存在多个极值，难以确定两个因素对软膏综合性评分的交互作用。

2.3.4 乳化温度（ A ）、硬脂酸（B ）、丙二醇（C ）与月桂氮卓酮（ D ）交互作用由图4 可知，乳化温度（ A ）、硬脂酸（ B ）、丙二醇（C ）与月桂氮卓酮（ D ）交互作用之间的响应面图呈现马鞍形曲面，即这三组交互作用不存在极值，交互作用不显著，不具有统计学意义。

上述与回归模型方差分析相符，据 Design- Expert11.0 建立模型进行参数优化分析，以软膏最高综合性评分为优化目标，可得到最佳工艺：乳化温度75.05℃，硬脂酸为27.68%，丙二醇为8.66%，月桂氮卓酮为5.00%，预测综合评分值为97.4分。根据实验条件进行修正：乳化温度70℃，硬脂酸为26%，丙二醇为7%，月桂氮卓酮为5%，并按照响应面优化后的条件，采用三萜化合物含量测定方法进行验证实验确认条件可行性。

2.4 验证实验

2.4.1 软膏最佳制备工艺验证选择修正后制备条件为：乳化温度70℃，硬脂酸为26%，丙二醇为 7%，月桂氮卓酮为3%。经过三次平行实验后，分别得到眼树莲软膏的综合性评分为97，96，98，平均为97分，其与预测值97.4分接近， RSD 值为 1.03%，说明误差较小，说明所建立的响应面优化模型真实可靠，结果表明该优化的软膏制备工艺具有重现性。

2.4.2 眼树莲软膏中总三萜类化合物的含量测定实验得到浓度为0 、0.01、0.02、0.05、0.10、 0.15 mg/mL 系列标准溶液，在550 nm 波长范围下，以系列齐墩果酸溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性方程为y=8.2651 x+0.0168，R2=0.999。回归分析浓度在0.0～0.15 mg/mL，吸光度与其溶液浓度成比例递增，可用于计算软膏中总三萜的含量。测得供试品的吸光度值，通过1.2.8公式计算得眼树莲软膏中总三萜类的含量，为 98.6%。结果表明，经过响应面法优化之后的眼树莲三萜类软膏中三萜类化合物的含量较高。

2.4.3 眼树莲软膏抗炎活性实验眼树莲软膏抗炎活性实验结果见表6。可以发现，眼树莲软膏外用能够抑制小鼠耳肿胀，与空白对照组比较，耳肿胀抑制率为45.35%，说明眼树莲软膏外用具有一定抗炎活性。

3 结论

目前，已知眼树莲总三萜提取物具有良好的抗炎效果，但是对于制备成软膏的相关研究还存在空白。杨俊等[22]对虎耳草软膏剂成型工艺进行了优选，张荣榕等[25]采用响应面法设计优化金鉴灵软膏的制备工艺，陈丽梅等[27]响应面法优化乳膏基质工艺参数均获得了较好的乳膏基质工艺参数。综合上述研究，采用单因素实验及 Box- Behnken 响应面分析法优化工艺，获得眼树莲总三萜软膏较为准确的工艺参数。

响应面分析是通过优化实验条件合理设计的方法，综合运用回归方程来拟合影响因素和响应值之间的关系，从而获得寻找最佳响应值的统计方法[28]。与传统的正交设计相比，既能体现提取过程中不同因素之间的交互作用关系，又能更加精确地筛选出提取工艺的最佳点，对于非线性响应因素的预测具有较强的指导性，应用价值较高[29]。通过单因素筛选实验，探究各因素对软膏综合性评分程度，最后借助响应面法优化眼树莲总三萜软膏基质制备工艺，最佳基质制备工艺结果为乳化温度70℃，硬脂酸为26%，丙二醇为7%，月桂氮卓酮為3%。在此条件下，软膏的综合性评分可达到最优值97分，并且得软膏中相应的总三萜含量较高。结果说明该软膏基质制备工艺具有较好的实用性，为进一步开发研制眼树莲作用的药物制剂提供一定的参考价值和理论依据。

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