成镜 李季 戴雪梅 徐正伟 周权男 黄天带

摘要    以TY-4番木瓜组培芽为试验材料，在以半强度Murashige和Skoog培养基为基本培养基，蛭石为支撑物的基础上，研究不同蔗糖浓度（0、5、20、40g/L）、吲哚-3-丁酸浓度（2、4、6、8 mg/L）、间苯三酚浓度（0、10.0、14.9、19.9 mg/L）對番木瓜生长状态和生根率及根系质量的影响。结果表明：将番木瓜组培芽在含蔗糖浓度为0，吲哚-3-丁酸（IBA）浓度为2 mg/L、间苯三酚浓度为0，并补充1/2强度的MS大量元素、MS微量元素、MS有机质，肌醇0.1 g/L、硫胺素0.4 mg/L和核黄素0.38 mg/L，支撑物为蛭石的培养基中培养时，体外芽最高生根率为95.2%，与最低的生根处理相比，高出38.1%，且茎基部形成愈伤组织较少。通过正交试验结果分析可知，番木瓜最佳的生根组合为：蔗糖浓度为0、吲哚-3-丁酸（IBA）浓度为2mg/L、间苯三酚浓度为10.0 mg/L。本研究可为番木瓜体外繁殖生根技术提供理论参考。

关键词    番木瓜;蔗糖;吲哚-3-丁酸;间苯三酚;生根;根系质量;器官发生;蛭石

中图分类号    S667.9    文献标识码    A    DOI：10.12008/j.issn.1009-2196.2022.02.010

Optimization of Rooting Medium for Tissue Culture of Papaya

CHENG Jing    LI Ji    DAI Xuemei    XU Zhengwei    ZHOU Quannan    HUANG Tiandai

（Rubber Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，P. R. China/State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation & Physiology of Tropical Crops /CATASRRI Engineering Center for Rapid Propagation of Tropical Woody Plants.，Haikou，Hainan 571101，China）

Abstract    Tissue cultured shoots of papaya variety “TY-4”were cultured on rooting mediums with the half-strength Murashige and Skoog medium as basic medium and vermiculite as the support，supplemented with sucrose at different concentrations （0，5，20，40 g·L），indole-3-butyric acid （IBA）at 2，4，6，8 mg·L，phloroglucinol at 0，10.0，14.9，19.9 mg·L to observe the effects of the three factors，sucrose，IBA and phloroglucinol，on the growth，rooting rate and root quality. An orthogonal experiment was arranged to optimize the concentrations of the sucrose，IBA and phloroglucinol in the rooting medium. The results showed that when papaya tissue cultured shoots were cultured on the rooting medium including 1/2 strength MS with vermiculite as support，supplemented with macro-elements，trace elements，organic matter，0.1 g·L inositol，0.4 mg·L thiamine and 0.38 mg·L riboflavin at the presence of 0 sucrose，2 mg·L IBA，and 0 phloroglucinol，the rooting rate of the shoots in vitro was upto 95.2%，which was 38.1% higher than that of the treatment with the lowest rooting rate，under which less calli were formed at the base of the shoots. The orthogonal experiment showed that the optimal combination of the three factors in the papaya rooting medium is sucrose at the concentration of 0，IBA at 2 mg·L，and phloroglucinol at 10.0 mg·L.

Keywords    papaya;sucrose;indole-3-butyric acid;phloroglucinol;rooting;root quality;organogenesis;vermiculite

番木瓜（Carica papaya L）是热带、亚热带地区广泛栽培的多年生果树，是国际上第四大畅销的热带、亚热带特色水果，原产于热带美洲，与香蕉、菠萝并称“热带三大草本果树”。目前，在我国的广东、海南、广西、云南、福建、四川等热区已形成一定的种植规模[1-3]。

番木瓜是从种子繁殖而来的，但实际上它是一种异花授粉的物种，通过种子繁殖无法保留亲代的某些特征（番木瓜植株按性别分为3种：雌株、雄株、两性株，性别由初期的X-Y染色体控制）。研究显示，在一个小的特定区域的Y染色体可以控制雄株（Y）或雌雄同株（Y）类型;雌株是XX类型，所有Y染色体和Y染色体都是不育的;因此，雄株和雌雄同株的类型都是杂合体（分别是XY和形式XY）。种子的繁殖还带来果实质量、大小以及生产力的变化。而且，各种形式的木瓜果实对于生产者来说是严重的问题，限制了木瓜商业化。优良植物的繁殖和新品种的开发需要有效的营养繁殖技术[4]。尽管可以通过嫁接和生根插条繁殖，但由于从亲本产生的植株数量有限，因此还不能满足商业化生产需求[5]。因此，使用可繁殖大量高质量植株的微繁技术是种植该作物的迫切需求。组织培养技术可作为育种程序中重要的措施，以克服常规育种和克隆繁殖中遇到的问题。尽管用番木瓜品种成功进行组织培养已有报道，但再生枝芽的主要问题是低生根率以及基部愈伤组织的形成，阻止了根的形成，适应驯化的生根植物的比例也很低[6]。体细胞胚的发芽还经常受到高水合度和根部位愈伤组织的影响[6-7]，番木瓜的体外培养中再生植物的驯化是世界范围内存在的最大问题。在田间种植之前，已经损失了超过70%的植株[8]。

近年来，体细胞胚发生技术已用于许多植物物种的快速繁殖。大规模繁殖的体外方案的成功取决于能否再生大量植物（低成本），并使其具有高成活率的体外条件[9-10]。然而，体细胞胚发生方案的商业化使从体外移植到离体移植后死亡或受损的植株比例很高，这仍是需要解决的问题[11]。一般而言，在半固体培养基中，通过体细胞胚发生获得的植物，一旦产生叶子和根系，即可适应离体条件。半固体培养通常会在解剖学、生理学和形态学方面产生异常植物[10]。实际上，这些植物的特征是由叶片角质层发育不良导致的光合作用弱、与维管束系统无关的无功能的根系问题以及其他可能影响植物在适应阶段生存的疾病[10-11]所引起的。

间苯三酚是生长调节剂，是木质素生物合成途径中Phloridzin及其前体降解的产物，是一种酚类化合物，因其具有促进植物生长的特性而闻名，尽管其作用通常被其他类似化合物所掩盖[12]。前人已证明，间苯三酚对木质化有积极作用[13-14]，减少了高水合过程[15]，并抑制从体细胞胚和胚芽获得的芽的愈伤组织形成。周鹏等[16]将经过壮苗培养的芽接种于MS+KT （0.1～0.2）mg/L+NAA （0.05～0.1）mg/L+IBA （0.2～0.3）mg/L+蔗糖（20～30）g/L+琼脂6.5 g/L（pH 5.6），26～28 ℃，每日光照培养12h，光照强度为1 500 lx，连续培养15～20 d进行催根培养，生根率达85%以上，该项研究的目的是使用蛭石作为支撑物，确定蔗糖、IBA、间苯三酚浓度对番木瓜芽生根的影响。本研究探讨不同因素对番木瓜生长的影响大小，并筛选出适合番木瓜根系生长的最佳组合，为下一步开展番木瓜规模快繁提供理论基础。

1    材料与方法

1.1    材料

TY-4番木瓜材料经鉴定为雌雄同株，采集于三亚市林业科学研究所塑料大棚内。

1.2    方法

1.2.1    正交试验设计    取生长状况良好且带有2～3片绿叶的芽为外植体（长1.5～2 cm），接種于含有1/2 MS大量、MS微量、MS有机、肌醇0.1 g/L，0.4 mg/L硫胺素和0.38 mg/L核黄素，不同蔗糖、吲哚-3-丁酸、间苯三酚浓度的培养基中，支撑物为蛭石;蔗糖、吲哚-3-丁酸、间苯三酚采用三因素四水平设计（表1）;培养容器为带透气膜的玻璃试管，pH 5.8，在温度25℃的条件下培养30d。对照处理（PS51）：蔗糖含量0，IBA浓度2 mg/L，间苯三酚二水化合物浓度12.8 mg/L;采用L（4）正交设计表，分别设置蔗糖浓度（因素A）、IBA浓度（因素B）、间苯三酚浓度（因素C）的三因素四水平正交试验（表2）。每个处理组合21个外植体，重复3次，接种1个月后统计生根情况：用水浸泡基质，待基质松软后，轻轻洗掉基质，取出根系，统计生根数和观察生根情况。

1.2.2    数据处理与统计分析    试验数据用Excel 2003和DPS 7.05软件进行处理和分析，用Tukey 法进行差异显著性分析。

2    结果与分析

2.1    正交试验设计结果分析

从表3可看出，不同培养基配方对番木瓜生根率的影响不同;其中PS35处理生根率最高，达95.2%;其次分别是PS36、PS37、PS38、PS39处理，生根率均达90.5%。虽然PS46处理的生根率也达到90%，但长出的根系短，茎基部形成大量愈伤组织，如图1所示。PS47、PS48、PS49、PS50处理的生根率最低，分别为61.9%、57.1%、57.1%、57.1%。可以看出，蔗糖浓度为0的处理，番木瓜生根率略高于蔗糖浓度为5、20 g/L的处理，且显著高于蔗糖浓度为40 g/L的处理。

从正交试验结果（表3、4）的直观分析可以看出，因素A（蔗糖浓度）对番木瓜生根率的影响较大，而因素B（IBA浓度）和因素C（间苯三酚浓度）对其影响较小。从表4的极值可确定，三因素对番木瓜生根率影响程度的主次顺序为：A>B>C;根据表4中各因素水平平均值的大小，可得番木瓜生根最优组合为ABC，即蔗糖浓度0、IBA浓度2mg/L、间苯三酚浓度10.0 mg/L。

从表5可看出，3个因素对试验结果的影响各有差异，其中因素A对本试验结果的影响显著，因素B和因素C对试验结果的影响没有达到显著水平，说明在番木瓜生根的过程中，不同蔗糖浓度对生根率的影响最大，而IBA浓度和间苯三酚浓度对生根率影响小。

2.2    不同处理植株生长状况

从图2可以看出，蔗糖浓度为0的PS37处理，叶片呈深绿色，随着蔗糖浓度（5～40 g/L）的升高，番木瓜黄叶情况明显，说明生根阶段低蔗糖浓度有利于番木瓜植株的健康生长。

2.3    不同处理根系生长情况

从图1 可以看出，PS35、PS36、PS37、PS38、PS39处理的番木瓜根系生长较好，根截面周围一圈都有根产生，有侧根形成，茎基部无愈伤组织形成且没有形成泡沫状根;而PS46处理，产生的根系短，茎基部形成较多愈伤组织，植株生长状况差，叶片变黄脱落。

3    讨论与结论

目前，在番木瓜组织培养过程中，生根率和生根状况一直是影响番木瓜快繁成本和田间移栽成活率的关键因素。然而，番木瓜高生根率和优质根系的实现，常受到诸多因素的综合影响。

因此，筛选出适合番木瓜根系生长的最佳组合条件就显得尤为重要。本研究通过正交试验设计获得了番木瓜生根的最优组合为ABC，即蔗糖浓度0、IBA浓度2 mg/L、間苯三酚浓度10.0 mg/L，与Laisyn Posada Perez 等[17]的研究结果一致。蔗糖是淀粉合成的前体物质，在植物组织培养中蔗糖是最理想的碳源之一，其作用是作为碳源和维持渗透压;培养基中的蔗糖浓度高时会产生较高的渗透压，使得植物组织中的水分向培养基渗透，最终导致植物组织缺水，进而影响其生长发育过程[18]。本试验中，随着蔗糖浓度的升高，番木瓜的黄叶数增加，这可能是由于培养基中的蔗糖浓度高，导致叶片中的水分向培养基渗透，并最终成为影响番木瓜芽生根率的主要因素。本研究得出的番木瓜生根的最优组合也可在其他作物的组培快繁体系中应用与推广，生根阶段减少使用蔗糖或者不使用蔗糖，不但能减少组培生产成本，且能减少因蔗糖而存在的污染风险。

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