梁雅旭,邓凯平,张真,高霄霄,王智博,王锋,樊懿萱

(南京农业大学江苏省家畜胚胎工程实验室,江苏 南京 210095)

多不饱和脂肪酸(polyunsaturatedfatty acids,PUFA)在减脂、提高免疫、抑制肿瘤血管生成和冠状动脉硬化等过程中发挥重要作用,是人类健康成长必不可少的物质[1]。因此,采用富含PUFA日粮饲喂动物的方法提高畜产品中PUFA含量已成为研究热点[2]。紫苏籽(perilla frutescens seed,PFS)中α-亚麻酸(α-linoleic acid,ALA)含量高达54%～64%,是很好的n-3 PUFA植物性来源,也是一种重要的蛋白质和能量饲料原料[3],在亚洲国家广泛分布且在畜牧业中取得很好的应用效果。有研究表明,PUFA通过调控自噬和凋亡改善机体健康状况[4],相关研究还十分有限,尤其给动物饲喂富含ALA的紫苏籽对其自噬和凋亡的影响尚无报道。

凋亡是细胞内的一种程序性死亡过程,最终整个细胞都被消化降解[5]。自噬是细胞自我保护的重要机制,通过降解胞内受损的细胞器和蛋白质,维持机体稳态[6]。据报道,ALA可以提高细胞自噬水平[7]。n-3 PUFA通过上调自噬相关基因微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)的表达水平和自噬体数量,进而诱导自噬[8]。过度或不充分的自噬和凋亡均会导致细胞损伤,最终影响肝脏功能的正常发挥。但是,ALA调控自噬和凋亡的分子机制有待深入研究。AMP依赖的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)参与自噬和凋亡等许多重要的生理过程。LKB1(activated liver kinase B-1)是AMPK的上游激酶,通过磷酸化AMPK(Thr172)调控自噬。雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,MTOR)是一种重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,参与调节多种生物学过程,包括细胞生长、增殖、存活、自噬和代谢等[9]。AMPK-MTOR是调控自噬的关键通路[10],AMPK通过抑制MTOR激活自噬[11]。综上所述,推测紫苏籽通过LKB1-AMPK-mTOR信号通路调控自噬和凋亡。

本课题组前期研究表明,日粮中添加15%(质量分数)PFS显著提高湖羊肌肉和肝脏中n-3 PUFA含量[12-13],获得的羊肉产品更有利于人类健康。然而,富含ALA的紫苏籽对湖羊肝脏自噬与凋亡的影响尚不清楚。本试验以2月龄湖羊为研究对象,借助实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,qPCR)和蛋白质印迹法(Western blot,WB)等方法探究日粮中添加PFS对肝脏自噬、凋亡及LKB1-AMPK-MTOR通路相关基因与蛋白表达的影响,为紫苏籽在畜牧业中的应用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物、分组处理与饲养管理

饲养试验在江苏省泰州市海伦羊业有限公司进行。选取30只体重相近(约23 kg)且健康状况良好的2月龄湖羊公羔,随机均分为2组:对照组和PFS组。每组3个重复,每个重复5只羊。试验共计84 d,预饲期14 d,正饲期70 d,对照组饲喂基础日粮,PFS组饲喂另添加质量分数为15%PFS的基础日粮。日粮组成见表1[9],紫苏籽的营养水平参见文献[12-13],其富含高达48.35%的α-亚麻酸。试验中所用的紫苏籽购自甘肃省正宁县金牛实业有限责任公司。试验羊分栏饲养,自然光照,自由饮水和采食全混合颗粒饲料。

表1 日粮组成(干物质基础)

1.2 样品采集

饲养试验结束后,每组随机挑选5只羊进行屠宰。屠宰前试验羊禁食24 h,不禁水。从胴体左侧采集约20 g肝脏组织,立即置于液氮中,带回实验室保存于-80 ℃超低温冰箱,用于后续qPCR和WB检测。

1.3 样品组织总RNA提取、cDNA合成和qPCR

肝脏组织中总RNA用Trizol试剂(Invitrogen,USA)提取,使用分光光度计(Thermo Scientific,USA)测定RNA的浓度。当D260/D280和D260/D230值处于1.8～2.0时,表示提取的RNA可用于后续试验。将RNA样品储存在-80 ℃冰箱备用。根据反转录试剂盒说明书(TaKaRa,大连)将RNA反转录成cDNA。以cDNA为模板,进行qPCR试验。qPCR反应体系为20 μL:SYBR 10 μL、cDNA 1 μL、超纯水7.8 μL、上游引物和下游引物各0.6 μL。qPCR反应条件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40个循环;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s[12-13]。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内参基因,采用2-ΔΔCT方法计算目的基因的相对表达水平。根据NCBI提供的序列信息,用Primer-BLAST设计引物。引物信息见表2。

表2 基因引物信息

1.4 肝脏中CASP3与CASP9酶活性的测定

取绿豆大小的组织,按照3～10 mg组织加100 μL裂解液的比例加入适量裂解液,在冰上用玻璃匀浆器匀浆。把匀浆液转移到1.5 mL离心管中,冰浴裂解5 min,4 ℃、16 000～20 000g离心10～15 min,把上清液转移至冰浴预冷的离心管中。依据试剂盒说明书(海门碧云天)立即测定CASP3与CASP9的酶活性。每个样品重复3次检测,取平均值。

1.5 Western blot检测蛋白的表达水平

用RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂混合物提取肝脏组织中的总蛋白。用BCA蛋白浓度检测试剂盒(海门碧云天)测定总蛋白浓度后进行蛋白变性。变性体系:25 μL LDS上样缓冲液、10 μL还原剂、含200 μg蛋白的原液,补充RNase Free水至100 μL。变性程序:70 ℃ 10 min。Western blot步骤:总蛋白通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(200 V,35 min)进行分离,100 V条件下转膜1 h,置TBST稀释的5%脱脂奶粉中封闭2 h,用5%脱脂奶粉稀释的一抗(PPARGC1A:1∶1 000、BECN1:1∶2000、LC3:1∶1 000、GAPDH:1∶8 000、AMPK:1∶1 000、LKB1:1∶500、p-AMPK:1∶2 000、MTOR:1∶1 000、p-MTOR:1∶1 000)孵育12～16 h(4 ℃),用5%脱脂奶粉稀释的二抗(HRP标记羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG,海门碧云天,1∶1 000)室温孵育2 h,使用ECL超敏发光液进行曝光,用ImageJ软件对条带进行灰度分析[7]。

1.6 数据处理与统计分析

2 结果与分析

2.1 日粮中添加紫苏籽对湖羊肝脏自噬相关基因表达水平的影响

从如图1可知:与对照组相比,日粮中添加15% PFS显著上调肝脏中核转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子1α(PPARGC1A)、BECN1、LC3、ATG5和ATG7mRNA表达水平(P<0.05)。日粮添加15% PFS对SQSTM1mRNA表达水平无显著影响(P>0.05)。

图1 日粮中添加15%紫苏籽(PFS)对湖羊肝脏自噬相关基因表达水平的影响

2.2 日粮中添加紫苏籽对湖羊肝脏自噬相关蛋白表达水平的影响

用Western blot检测湖羊肝脏中自噬相关蛋白表达水平。结果如图2所示:与对照组相比,日粮中添加15% PFS显著上调肝脏中PPARGC1A和BECN1蛋白表达水平(P<0.05),对LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值无显著影响(P>0.05)。

图2 日粮中添加15% PFS对湖羊肝脏自噬相关蛋白表达的影响

2.3 日粮中添加紫苏籽对湖羊肝脏凋亡相关基因表达水平的影响

用qPCR检测湖羊肝脏中凋亡相关基因表达水平。结果如图3所示:与对照组相比,日粮中添加15% PFS对肝脏中凋亡相关基因Bax、Bcl2、CASP3、CASP9和P53mRNA表达水平均无显著影响(P>0.05)。

图3 日粮中添加15% PFS对湖羊肝脏中凋亡相关基因mRNA表达的影响

2.4 日粮中添加紫苏籽对湖羊肝脏中CASP3和CASP9活性的影响

如图4所示:与对照组相比,日粮中添加15% PFS对肝脏中CASP3和CASP9活性均无显著影响(P>0.05)。

图4 日粮中添加15% PFS对湖羊肝脏中CASP3和CASP9活性的影响

2.5 日粮中添加紫苏籽对LKB1-AMPK-MTOR信号通路中关键基因和蛋白表达水平的影响

采用qPCR检测LKB1-AMPK-MTOR信号通路中关键基因在湖羊肝脏中的表达水平,进一步探索日粮中添加紫苏籽对湖羊肝脏自噬的调控机制。如图5-A所示:与对照组相比,15% PFS显著上调肝脏中LKB1、AMPK和MTORmRNA表达水平(P<0.05)。

Western blot检测结果如图5-B所示:与对照组相比,日粮中添加15% PFS对LKB1蛋白表达水平以及p-AMPK/AMPK和p-MTOR/MTOR比值均无显著影响(P>0.05)。

图5 日粮中添加15% PFS对湖羊肝脏中LKB1-AMPK-MTOR通路关键基因(A)和蛋白(B)表达水平的影响

3 讨论

3.1 日粮中添加紫苏籽对湖羊肝脏自噬的影响

自噬是细胞自我保护的一种重要机制,细胞通过降解受损的蛋白质和细胞器,维持机体的内环境稳态,该过程障碍会导致许多疾病发生。研究发现,n-3 PUFA可以增强自噬活动,保护由于严重肝损伤引起的急性免疫系统过度反应[14]。PPARGC1A在细胞自噬中发挥重要作用。据报道,PPARGC1A能够激活溶酶体合成,提高转录因子EB(TFEB)表达水平,维持线粒体合成与自噬之间的平衡[15]。Flachs等[16]发现n-3 PUFA能够上调小鼠前脂肪细胞(3T3-L1)细胞中PPARGC1A表达水平。郑双等[17]报道紫苏籽油性提取物显著提高ApoE-/-小鼠心脏组织中PPARGC1A基因表达水平。本试验中15% PFS组湖羊肝脏中PPARGC1A的mRNA和蛋白表达水平均显著上调,与上述研究结果一致。BECN1参与自噬小体的形成,是启动自噬的标志分子,其突变或缺失均会降低自噬水平[18]。ATG5主要以ATG12-ATG5-ATG16复合物形式调控自噬,ATG7是参与ATG12-ATG5-ATG16复合物形成的关键酶。本研究中富含ALA的紫苏籽显著上调ATG5、ATG7和BECN1mRNA表达水平,与Deng等[7]发现ALA提高脂肪细胞中ATG5和BECN1mRNA表达水平的结果一致。以上结果均表明,富含ALA的紫苏籽显著提高肝脏中细胞的自噬水平。

PUFA存在双键,含有过高水平PUFA的组织容易发生脂质氧化[19]。本课题组前期研究表明,紫苏籽增加了湖羊肌肉和肝脏中n-3 PUFA含量,但没有对机体造成氧化应激[12-13]。结合本试验结果,我们推测富含ALA的紫苏籽可能通过提高肝脏中自噬相关基因与蛋白的表达水平,维持ROS与自噬之间的平衡,缓解氧化应激。

3.2 日粮中添加紫苏籽对湖羊肝脏凋亡的影响

凋亡是由基因调控的细胞程序性死亡途径,表现出细胞收缩、凋亡小体形成和核染色质凝聚等形态学特征。细胞凋亡有助于组织内细胞群的稳定及机体防御和免疫反应的正常进行[20]。Bcl-2家族在调控细胞凋亡中发挥重要作用,其中Bax能够促进凋亡,Bcl2抑制凋亡[21],Bax/Bcl2比值上升表明细胞凋亡增强,比值下降表明细胞凋亡下降。Bcl2家族可以调控CASP家族相关基因与蛋白的表达,其中CASP3与CASP9分别通过死亡受体途径和线粒体途径介导细胞凋亡[22]。PUFA能够选择性杀死肿瘤细胞,但是不会破坏正常细胞[23]。n-3 PUFA能够降低急性肺损伤大鼠肺泡上皮细胞的凋亡水平[24],缓解脂多糖对新生大鼠造成的氧化应激和细胞凋亡,对脂多糖所致的脑损伤大鼠也有保护作用[25]。本研究发现,富含ALA的紫苏籽有降低肝脏细胞凋亡的趋势,即15% PFS组凋亡相关基因Bax、Bcl2、CASP3、CASP9mRNA和CASP3、CASP9酶活性有下降的趋势。原因可能是本研究中所使用的试验动物是正常的湖羊,而前人研究是选用应激的大鼠。

3.3 日粮中添加紫苏籽对LKB1-AMPK-MTOR信号通路的影响

AMPK由催化α亚基和2个调节亚基β和γ复合组成,其N-末端含有保守丝氨酸(Ser)/苏氨酸(Thr)激酶区,该区域保守Thr172位点开启后可激活多条信号通路,在自噬、凋亡、抗氧化和能量平衡等生理过程中发挥重要作用[26]。LKB1是AMPK的上游激酶,通过磷酸化AMPK的Thr172位点调控自噬,AMPK-MTOR轴是自噬的关键通路之一[27]。机体处于健康状态时,由MTOR、RPTOR、ULK1、ATG101、FIP200和ATG13组成的雷帕霉素靶蛋白复合体1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)通过抑制自噬,促进脂质发生和细胞生长。当机体处于应激状态时,AMPK被磷酸化并激活MTOR的调控相关蛋白RPTOR,抑制mTORC1而激活自噬,消除或者修复受损的蛋白质和细胞器。Shin等[28]研究表明n-3 PUFA在细胞内产生的ROS能够抑制AKT-MTOR通路,诱导细胞自噬。Jing等[29]发现PUFA能够激活AMPK-MTOR信号通路进而提高细胞自噬水平。在本试验中,富含ALA的紫苏籽显著上调LKB1-AMPK-MTOR通路相关基因LKB1、AMPK和MTOR的表达水平。以上结果提示,富含ALA的紫苏籽可能通过提高LKB1-AMPK-MTOR通路关键基因的表达水平而诱导自噬。

LKB1-AMPK轴和PPARGC1A在脂代谢中也发挥重要作用。LKB1直接抑制脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)和乙酰辅酶A羧化酶(acetylCoA carboxylase α,ACC)活性,降低脂肪酸合成速率。AMPK通过磷酸化3-羟基-3甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶,抑制胆固醇合成,通过磷酸化ACC,降低脂肪酸合成[30];AMPK通过磷酸化甘油磷酸酰基转移酶和激素敏感酯酶,加快胆固醇酯和甘油酯的水解[31]。AMPK被LKB1激活后,作用于过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor alpha,PPARα),增加长链脂酰CoA合成酶、肉碱棕酰转移酶以及ACC氧化酶的生物活性,促进脂肪酸的氧化,降低脂肪酸的合成能力[32]。PPARGC1A可以激活PPARα和PPARγ,提高参与脂肪酸β氧化酶和受体的表达水平[33-34],进而改善高脂诱导的脂代谢紊乱[35],降低细胞中的脂质积累。本课题组前期研究发现,15% PFS上调肝脏和背最长肌中PPARα和PPARγmRNA水平,降低了ACC和FASNmRNA表达水平[12],此结果与本试验中15% PFS显著上调LKB1、AMPK和PPARGC1AmRNA表达水平一致。提示富含ALA的紫苏籽可能通过上调LKB1、AMPK和PPARGC1A基因表达水平来调控脂代谢,但具体机制仍有待进一步研究。

综上,日粮中添加富含PUFA的15%紫苏籽显著上调湖羊肝脏中PPARGC1A、BECN1、ATG5、ATG7、LKB1、AMPK和MTOR基因以及PPARGC1A和BECN1蛋白表达水平,并可能以此提高肝脏细胞自噬水平,但是具体的分子机制有待深入研究。以上结果将为紫苏籽在湖羊上的应用奠定理论基础。