杨越莛，郑枫，蔡浒，柳文媛，2*（. 中国药科大学药物分析系，南京 298；2. 浙江省原料药安全研究中心（工艺技术创新平台），杭州 3008）

基因毒性杂质（genotoxic impurities，GTIs），又称遗传毒性杂质，是一类具有致癌性和致突变性的特殊杂质。该类物质大多具有亲电活性，能与DNA发生共价结合并对其造成直接或间接损伤，从而进一步诱导肿瘤或遗传疾病的生成。

与一般杂质不同，基因毒性杂质在极低浓度时便可触发效应，其低水平高毒性的特点引起了医药行业的广泛关注，严格控制药物中基因毒性杂质也显得格外重要起来。

2018年，“缬沙坦事件”的爆发将基因毒性杂质带进了大众视野之中，各国监管部门也开始出台和完善相关指导原则。研究表明，

N

-亚硝基类化合物在经体内代谢后会表现出极强的基因毒性，严重威胁人类健康。早在1987年，国际癌症研究机构就明确把

N

-亚硝基二甲胺（

N

-nitrosodimethylamine，NDMA）和

N

-亚硝基二乙胺（

N

-nitrosodiethylamine，NDEA）列为2A类致癌物质；ICH《M7（R1）：评估和控制药物中DNA反应性（致突变）杂质以限制潜在的致癌风险》也将该类化合物归属于“关注队列”之中，旨在让药学研究者们给予高度重视。间苯三酚注射液主要适用于消化系统以及胆道功能障碍引起的急性痉挛性疼痛，其活性成分为三甲基间苯三酚（trimethyl phloroglucinol，TMP）和间苯三酚二水合物（phloroglucinol，PGO），同时TMP也是PGO工艺路线中间体1，3，5-三甲氧基苯（1，3，5-tribromobenzene，PGO-1）精制后的成品，合成路线见图1。以苯胺为原料进行间苯三酚起始物料1，3，5-三溴苯（1，3，5-tribromobenzene，PGO-01）的合成，在这一步骤中残留的重氮化试剂可能会造成亚硝酸钠污染，进而与

N

，

N

-二甲基甲酰胺中的二甲胺和二乙胺反应生成NDMA和NDEA。

图1 PGO合成工艺路线Fig 1 Synthesis of PGO

目前常用的NDMA和NDEA分析方法有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、液相色谱-质谱联用法（LC-MS）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）等。由于亚硝胺杂质的残留水平一般较低，常规检测器往往不能满足其检测要求，因此在分析该类杂质时通常会考虑衍生化方法或是选择高分辨检测器以提高方法的灵敏度。为保证药品质量以及用药安全，需对间苯三酚中间产物TMP中可能含有的基因毒性杂质NDMA和NDEA进行分析与控制。目前国内外尚未有相关研究报道，因此本研究旨在建立一套适用于TMP中NDMA和NDEA检测的高效液相色谱-串联质谱法，该方法专属性强，灵敏度高，准确度和重复性好，可为间苯三酚注射液原料药的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Shimadzu LC-20AT液相色谱仪（LC-20AT二元梯度泵、SIL-20A自动进样器、CTO-20AC柱温箱，日本岛津公司）；SCIEX TRIPLE QUAD 3500质谱仪（美国AB Sciex公司）；赛多利斯SQP电子天平、赛多利斯BSA124S电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；KH-250DB型数控超声波清洗仪（昆山禾创超声仪器有限公司）。

1.2 试药

NDMA（含 量：97.80%，批 号：510166-201902）、NDEA（含量：99.70%，批号：510168-201902）（对照品，中国食品药品检定研究院）；TMP供 试 品（批 号：20191201、20191202、20191203，扬州三药）；甲醇（色谱级，批号：1069707004，德国默克）；甲酸（色谱级，批号：C11119020，上海麦克林生化科技有限公司）；实验用水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Inertsil ODS-3色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.1%甲酸溶液（A）-甲醇（B）；梯度洗脱程序见表1；柱温：40℃；流速：1.0 mL·min；进样量：60 μL。

表1 梯度洗脱程序
Tab 1 Gradient elution program

时间/min 流动相A/% 流动相B/%0.01 85 15 2.00 85 15 2.01 30 70 5.50 30 70 5.51 85 15 10.00 85 15

2.2 质谱条件

离子源：大气压化学电离源（APCI）；检测模式：正离子模式，多重反应监测（MRM）；气帘气压力（CUR）：35 psi；碰撞气（CAD）：8 psi；雾化电流（NC）：3.0 μA；离子源温度（TEM）：650℃；雾化气（GS1）：65 psi；NDMA离子对（

m/z

）：75.1/58.2、去簇电压（DP）：42 V、碰撞气能量（CE）：18 eV、驻留时间：400 ms；NDEA离 子 对（

m/z

）：103.0/75.1、DP：19 V、CE：22 eV、驻留时间：200 ms；阀切换程序：0.00 min，B阀；2.20 min，A阀；6.00 min，B阀。

2.3 溶液配制

2.3.1 空白溶剂 即稀释溶剂，0.1%甲酸溶液∶甲醇＝85∶15。

2.3.2 混合对照品溶液 取NDMA约24 mg或取NDEA约13 mg，精密称定，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得NDMA或NDEA对照品储备液。精密移取NDMA对照品储备液0.2 mL和NDEA对照品储备液0.1 mL，置于100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；精密移取上述溶液1 mL，置于50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.3 标准限度混合杂质对照溶液 精密移取混合对照品溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，加稀释溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.4 TMP供试品溶液 取TMP供试品约200 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，加甲醇超声溶解，加稀释溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.5 供试品加样溶液 取TMP供试品约200 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，精密移取混合对照品溶液1 mL，加甲醇超声溶解，加稀释溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4 专属性

分别取空白溶剂、标准限度混合杂质对照溶液、TMP供试品溶液及供试品加样溶液进样分析并记录色谱图，结果显示NDMA和NDEA的测定不会受到干扰，方法专属性良好，见图2。

图2 TMP中NDMA和NDEA测定的典型色谱图Fig 2 Typical chromatogram of NDMA and NDEA in TMP

2.5 检测限和定量限

精密移取“2.3.2”项下混合对照品溶液，逐级稀释合适倍数后进样，分别将信噪比（

S/N

）为3和10作为检测限和定量限。结果NDMA的检测限为0.8454 ng·mL，定量限为2.818 ng·mL；NDEA的检测限为0.2340 ng·mL，定量限为0.7800 ng·mL。

2.6 线性关系考察

分别精密移取“2.3.2”项下混合对照品溶液0.3、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0 mL， 置 于10 mL量瓶中，加稀释溶剂稀释，制得系列线性溶液。以待测杂质峰面积（

y

）对其质量浓度（

x

，ng·mL）作图并进行线性回归计算，结果NDMA的回归方程为

y

＝3638.1

x

＋1156.9，

r

＝0.9996，线性范 围为2.818～18.79 ng·mL，NDEA的回归方程为

y

＝2183.6

x

＋38.444，

r

＝0.9998，线性范围为0.7800～5.200 ng·mL。

2.7 精密度

取“2.3.3”项下标准限度混合杂质对照溶液，连续进样6次，记录各杂质的峰面积和保留时间。结果显示，NDMA峰面积的

RSD

为1.5%，保留时间的

RSD

为0.12%；NDEA峰面积的

RSD

为4.7%，保留时间的

RSD

为0.060%，表明仪器精密度良好。

2.8 重复性和中间精密度

平行配制两份标准限度混合杂质对照溶液、6份TMP供试品溶液和6份供试品加样溶液来考察方法重复性。结果显示NDMA和NDEA含量的

RSD

分别为1.7%和6.2%，表明方法重复性良好。不同分析人员在不同日期重复上述试验考察方法中间精密度，结果显示NDMA和NDEA含量的

RSD

分别为2.3%和6.3%，精密度试验中NDMA和NDEA含量的

RSD

分别为2.3%和6.0%，表明方法中间精密度良好。

2.9 回收试验

分别平行配制两份标准限度混合杂质对照溶液和3份TMP供试品溶液，按“2.3.5”项下方法配制杂质限度为50%、100%和150%的供试品加样溶液，每个水平平行配制3份。结果NDMA和NDEA的平均回收率在98.82%～107.49%，

RSD

在1.7%～3.4%。

2.10 稳定性

取标准限度混合杂质对照溶液、TMP供试品溶液和供试品加样溶液室温放置，分别在0、3、6、9、12和15 h进样分析，记录各杂质峰面积并计算其变化率。结果显示标准限度混合杂质对照溶液中NDMA和NDEA的峰面积变化率分别低于3.6%和6.1%；供试品加样溶液中NDMA和NDEA的峰面积变化率分别低于4.4%和11.2%，表明溶液稳定性良好。

2.11 耐用性

改变流动相的起始比例（%）、流速（mL·min）、柱温（℃）和不同型号色谱柱以考察分析环境的微小变动对方法的影响，发现在各个色谱条件下NDMA和NDEA的检测均不会受到干扰，方法耐用性良好，具体结果见表2。

表2 NDMA和NDEA的耐用性试验结果
Tab 2 Durability test of NDMA and NDEA

色谱条件 NDMA含量/% RSD/% NDEA含量/% RSD/%标准条件 0.000 045 47 3.3 0.000 012 99 5.0流动相86∶14 0.000 046 51 0.000 013 45流动相84∶16 0.000 048 52 0.000 012 18标准条件 0.000 045 47 2.0 0.000 012 99 6.0流速0.9 mL·min－1 0.000 045 60 0.000 013 11流速1.1 mL·min－1 0.000 047 14 0.000 014 44标准条件 0.000 045 47 1.7 0.000 012 99 5.7柱温39℃ 0.000 046 22 0.000 013 26柱温41℃ 0.000 047 07 0.000 011 89标准条件 0.000 045 47 2.6 0.000 012 99 1.4更换色谱柱 0.000 047 17 0.000 013 25

2.12 样品检测

分别取3批TMP样品（批号：20191201、20191202、20191203）进行检测，结果均无NDMA和NDEA检出。

3 讨论

3.1 NDMA和NDEA的限度制订

N

-亚硝基类杂质致癌风险普遍较高，若完全按照ICH M7（R1）指南提出的毒理学关注阈值（TTC）1.5 μg·d来进行限度控制并不合理。对于NDMA和NDEA这类有相关致癌性试验数据的杂质而言，可通过在数据库中查找

TD

值来计算每日可接受摄入量（acceptable intake，AI）。目前，美国食品药品监督管理局（FDA）公布了NDMA和NDEA的AI值分别为96 ng·d和26.5 ng·d。为实现

N

-亚硝基类杂质的严格控制，按国内说明书记载的最大用药剂量200 mg·d计算，将TMP原料药中NDMA和NDEA限度分别制订为0.48 μg·g和0.13 μg·g。

3.2 条件优化

本研究在前期方法摸索时分别考察了水-甲醇、0.1%甲酸溶液-甲醇和0.1%甲酸溶液-0.1%甲酸甲醇溶液三种流动相。经比较发现，水-甲醇体系下NDMA峰形矮胖，响应较低。通过在水相中添加甲酸能够明显改善上述问题，而继续在有机相中添加甲酸并不会对NDMA和NDEA的峰形及响应造成太大影响。因此，为在保证试验结果的同时尽可能简化操作步骤，最终选择了0.1%甲酸溶液-甲醇。

在色谱柱的选择上，先后考察了Megres C柱、Ultimate XB-C柱和Inertsil ODS-3柱。其中，Megres C柱在使用过程中压力太高，超过仪器可承受的最大压力；Ultimate XB-C也存在压力偏高的问题，虽可使用，但各待测物色谱峰普遍出峰较晚，分析时间长，故也不选用。而Inertsil ODS-3柱较好地解决了上述问题，在有效缩短分析时长的同时，还能保证理想的分离度与峰形，因此最终选择了Inertsil ODS-3柱。

在离子源的选择上，先后比较了电喷雾电离源（ESI）和APCI两种常用的离子源。使用ESI时发现NDMA和NDEA响应均比较低，灵敏度较差；而APCI作为一种有效的电离补充方式可以较好地解决这一问题，这可能与NDMA和NDEA自身的分子量以及极性有关。基于上述试验结果，最终选择APCI为电离方式。

3.3 总结与展望

本研究建立了TMP原料药中基因毒性杂质NDMA和NDEA的检测分析方法并完成了相应的全套方法学验证。结果显示，该法能够同时对NDMA和NDEA进行准确定量分析，可为间苯三酚注射液原料药的质量研究提供参考，保障药品有效性与用药安全性。