周太敏，何华，徐娇，江维克，潘琪，张成刚，周涛（贵州中医药大学，贵阳 550025）

中药材续断来源于川续断科植物川续断

Dipsacus asper

Wall. ex Henry的干燥根，具有补肝肾、强筋骨、续折伤等功效。川续断皂苷Ⅵ是续断药材质量评价的指标成分，现代药理研究表明其能预防骨质疏松、镇痛。2020年版《中国药典》规定续断药材需进行发汗加工。已有研究结果表明，续断经发汗加工后，川续断皂苷Ⅵ的含量会显著升高，但是其对应的机制尚不清楚。研究表明，真菌在促进萜类、生物碱类等中药活性成分的转化及积累中发挥作用，可以用于提高中药活性成分的含量，其对应的机制主要包括提供底物转化的关键酶以及作为诱导子激发特定次级代谢产物的合成。赵慧在厚朴发汗的研究中发现，不同发汗阶段的厚朴中内生真菌的数量存在差异，而内生真菌会对厚朴次级代谢产物的形成具有一定影响。

基于上述研究背景，推测续断发汗后药材中川续断皂苷Ⅵ含量的变化与其真菌群落的构成有一定关系。因此，本研究在前期建立的续断发汗条件的基础上，对续断发汗前后药材中的真菌群落进行高通量测序，分析发汗前后续断中的真菌群落差异，筛选出发汗续断中的优势菌，将优势菌制备成诱导子与川续断无菌苗共培养，探讨优势菌对发汗药材中川续断皂苷Ⅵ含量变化的影响，为解析中药材发汗加工的科学内涵奠定理论基础。

1 材料

1.1 试药

新鲜川续断、川续断成熟种子采于贵州省龙里县，经贵州中医药大学江维克教授鉴定为川续断科植物川续断

Dipsacus asper

Wall. ex Henry。将根洗净，切段，取部分进行发汗处理，标记为DP3，未发汗样品标记为CK。川续断无菌苗来源于贵州中医药大学中药民族药资源研究院组培室；镰刀菌属（

Fusarium

sp.）菌株J35由本课题组从川续断中分离鉴定。

对照品川续断皂苷Ⅵ（批号：111685-201305，纯度：99.29%，成都埃法生物科技有限公司）；乙腈（色谱纯）、95%乙醇（分析纯）（国药集团化学试剂有限公司）；水为自制超纯水；其他试剂均为分析纯。微生物总DNA提取采用DNA试剂盒（Omega Biotek）；在上海美吉生物医药科技有限公司进行微生物测序。

1.2 仪器

Waters e2695高效液相色谱仪（Alliance 2695，美国沃特斯公司）；电子天平（AG285，瑞士梅特勒公司）；振荡培养箱（BSD-150，上海博讯医疗生物仪器）；PCR扩增仪（ABIGene Amp 9700型，美国）；5810R台式冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；Nanodrop 2000微量核酸定量分析仪（美国Thermo公司）。

2 方法

2.1 续断发汗前后样品的DNA提取和测序

将发汗前后的样品分别用液氮研磨成细粉，平均分为3份，DNA试剂盒提取总DNA，检测样品DNA浓度和纯度，PCR扩增真菌ITS1区，引物：ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R （5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）。扩增体系：引物ITS1F（5 μmol·L）和ITS2R（5 μmol·L）各0.8 μL，10×缓冲液和dNTPs（2.5 mmol·L）各2 μL，rTaq Polymerase 0.2 μL，BSA 0.2 μL，DNA模 板 10 ng，超 纯 水补足至20 μL。PCR扩增程序为：95℃预变性3 min，30个循环（95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s），72℃后延伸10 min。将真菌扩增子构建Miseq文库并测序。

2.2 测序数据分析

原始序列使用Flash（1.2.11）软件进行序列拼接，Fastp 软件质控。根据聚类分析序列之间的相似性分为多个操作单元（Operational taxonomic unit，OTU），序列相似性域值97%，Usearch软件（http：//www.drive5.com/usearch/）对物种OTU进行聚类和生物信息统计分析。RDP classifier 软件（https：//sourceforge.net/projects/rdp-classifier/）对每条序列进行物种分类注释。真菌ITS数据库为Unite（Release 8.0 http：//unite.ut.ee/index.php）。利用Mothur软件（https：//www.mothur.org/wiki/Download_mothur）进行Alpha多样性分析；基于分类学信息（域、界、门、纲、目、科、属、种），运用R语言等相关软件对发汗前后样本的群落组成进行分析。根据发汗前后真菌物种差异分析得到的群落丰度数据，找出具有显著差异的物种。

2.3 真菌诱导子的制备及共培养

镰刀菌属（

Fusarium

sp.）菌株J35接种于PDA液体培养基中，在摇床上以200 r·min的转速培养5 d，分为两份。一份用于川续断皂苷Ⅵ含量分析，另一份用于制备真菌诱导子。121℃高温高压灭菌20 min，分离出菌丝体，接种至生长状况健康且较一致的组培苗，共培养60 d，采用HPLC检测川续断皂苷Ⅵ含量。

2.4 川续断皂苷Ⅵ含量的测定

2.4.1 对照品溶液的制备 取适量川续断皂苷Ⅵ对照品精密称定，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，稀释至质量浓度为0.1016 mg·mL。

2.4.2 供试品溶液的制备 取“2.3”项下PDA液体培养基发酵培养的真菌，分离菌丝及发酵液。量取发酵液40 mL减压浓缩至黏稠，甲醇定容至40 mL，超声40 min，过滤，浓缩，吸取2 mL色谱甲醇溶解，0.45 μm滤膜过滤，即得样品。菌丝用甲醇定容至40 mL，后续制备同发酵液。菌株J35制备的诱导子与川续断无菌苗共培养60 d后，去除无菌苗根表面琼脂，清水洗净，45℃烘干。磨成细粉，称取10 mg于2 mL离心管中，吸取1.5 mL甲醇，超声30 min，放冷。离心，吸取上清液于2 mL离心管中，挥干，精密吸取400 μL色谱甲醇溶解，0.45 μm滤膜过滤，即得样品。

2.4.3 色谱条件 色谱柱为Symmetry-C（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-水（30∶70），检测波长为212 nm，进样量为20 μL，流速为1.0 mL·min，柱温为30℃。

3 结果与分析

3.1 续断发汗前后样品测序数据统计

发汗前后样品的原始数据经过质控及过滤后，获得序列数及序列长度等信息，见表1。序列数平均52 448条；碱基数平均为13 343 250 bp；每条序列平均长度为255 bp。CK和DP3样本的Coverage指数超过99%（见表2），表明样本中大多数真菌群落均检测到，数据质量可靠，可用于后续分析。

表1 续断发汗前后样品的测序数据
Tab 1 Sequencing data in crude and sweated

样品信息 序列数/条 碱基数/bp 序列长度/bp CK_1 49 808 13 793 650 277 CK_2 47 057 12 442 372 264 CK_3 51 635 13 577 654 263 DP3_1 50 195 12 202 047 243 DP3_2 53 205 12 842 421 241 DP3_3 62 788 15 201 356 242

3.2 Alpha多样性分析

对发汗前后样品的Alpha多样性指数的分析见表2。Shannon和Simpson指数均可反映样品中微生物的多样性。Simpson指数值越大，说明群落多样性越低；而Shannon值越大，说明群落多样性越高。根据上述衡量标准，结合CK和DP3样本的Shannon和Simpson指数，表明发汗后续断中真菌群落的多样性升高，但是两者差异并无统计学意义。进一步对两组样本的Ace和Chao指数进行了分析，结果表明Ace和Chao指数在DP3样品中均较高，表明发汗后续断中真菌群落的丰富度显著提高。

表2 续断发汗前后样品的Alpha多样性评估指数统计
Tab 2 Alpha diversity evaluation indexes in both crude and sweated

注：与CK相比，＜0.05，＜0.01。
Note：Compared with the CK，＜0.05，＜0.01.

评估指数 CK DP3 Shannon 2.731±0.265 3.236±0.011 Simpson 0.155±0.053 0.101±0.004 Ace 154.150±13.545 222.940±16.857**Chao 154.82±13.732 222.400±16.165**Coverage 0.999±4.250×10－5 0.999±6.40×10－5*

3.3 续断发汗前后样品的真菌群落组成及优势菌分析

CK和DP3样品在属水平上的真菌组成见图1。续断发汗前后样品中共鉴定到200个属的真菌群落，其中有35个属的真菌群落在发汗前后样品中的相对丰度具有显著差异（见表3），表明续断发汗前后样品中真菌组成的种类没有改变，但是其相对丰度发生了明显变化。由表3可知，续断发汗后，蜜环菌属 （

Armillaria

sp.）及螺旋聚孢霉属（

Clonostachys

sp.）的真菌相对丰度分别下降了77%和81%，而镰刀菌属（

Fusarium

sp.）真菌的相对丰度是发汗前的16.8倍左右，成为了优势菌属。

表3 续断发汗前后样品真菌相对丰度差异性分析
Tab 3 Difference of fungi relative abundance in crude and sweated

注：与CK相比， ＜0.05，＜0.01，＜0.001。
Note：Compared with the CK，＜0.05，＜0.01， ＜0.001.

菌属 CK相对丰度 DP3相对丰度Armillaria sp. 33.140±8.522 7.487±0.910*Fusarium sp. 1.635±1.105 27.520±0.874***Clonostachys sp. 14.760±2.722 2.768±0.315*Minimelanolocus sp. 6.560±0.176 3.966±0.130*unclassified_f_Herpotrichiellaceae 1.935±0.317 5.786±0.388***Cyphellophora sp. 5.756±0.836 1.032±0.042*Cladosporium sp. 0.610±0.112 4.414±0.603**Alternaria sp. 0.240±0.054 3.055±0.781*Ilyonectria sp. 0.407±0.259 2.497±0.090**Neocosmospora sp. 0.149±0.045 2.283±0.112*Dactylonectria sp. 0.716±0.159 1.300±0.096**Plectosphaerella sp. 0.122±0.135 1.083±0.399*Macrophomina sp. 0.011±0.012 1.161±0.358*Cephalotrichum sp. 0.925±0.244 0.163±0.060*Titaea sp. 0.782±0.217 0.235±0.024*Filobasidium sp. 0.292±0.173 0.721±0.0417*Gibberella sp. 0.031±0.031 0.980±0.115**Trichoderma sp. 0.052±0.011 0.716±0.267*unclassified_o_Branch06 0.526±0.111 0.115±0.022*Thanatephorus sp. 0.126±0.027 0.270±0.062*Aureobasidium sp. 0.049±0.021 0.342±0.116*Alatospora sp. 0.317±0.073 0.031±0.013*Penicillium sp. 0.270±0.071 0.055±0.013*Hannaella sp. 0.032±0.032 0.277±0.093*unclassified_o_Saccharomycetales 0.003±0.005 0.260±0.099*unclassified_f_Nectriaceae 0.047±0.028 0.160±0.026**Dictyocheirospora sp. 0.061±0.021 0.136±0.024*Colletotrichum sp. 0.006±0.010 0.184±0.055*Cladophialophora sp. 0.159±0.058 0.009±0.009*Cylindrocarpon sp. 0.025±0.012 0.117±0.019**Haematonectria sp. 0.009±0.015 0.010±0.038*Metarhizium sp. 0.008±0.014 0.045±0.011*Setophoma sp. 0.001±0.002 0.051±0.010*Uncispora sp. 0 0.212±0.076*Memnoniella sp. 0 0.084±0.021*

图1 CK和DP3样本中真菌在属水平上群落组成分析Fig 1 Community composition of fungi in CK and DP3 samples at the genus level

3.4 优势菌属的真菌J35对川续断无菌苗中川续断皂苷Ⅵ含量的影响

课题组利用前期从川续断中分离的镰刀菌属内生真菌J35（

Fusarium

sp.）进行相关样品中川续断皂苷Ⅵ含量的检测，结果显示，J35发酵培养的发酵液及分离的菌丝体中虽未检测到川续断皂苷Ⅵ，但J35菌丝体制备的诱导子与川续断无菌苗共培养60 d后，川续断皂苷Ⅵ含量相比对照组（未加诱导子的川续断无菌苗）显著提高了约5.4倍（见图2）。该结果表明，J35制备的诱导子能够促进川续断皂苷Ⅵ的积累，推测续断发汗后川续断皂苷Ⅵ含量升高与镰刀菌属真菌相关，可能与镰刀菌属真菌产生的中间代谢产物激发的信号通路有关。

图2 不同处理样品中川续断皂苷Ⅵ的含量比较分析Fig 2 Comparative analysis of asperosaponinⅥ content in different treatment samples

4 讨论

本研究通过真菌群落的高通量测序，发现续断发汗后真菌群落的物种多样性及丰富度均提高，镰刀菌属 （

Fusarium

sp.）、新赤壳属（

Ilyonectria

sp.）以及赤霉菌属（

Gibberella

sp.）等真菌群落的相对丰度显著提高，表明发汗过程促进了上述真菌的增殖和代谢，这可能是发汗改变了续断药材的温、湿条件从而影响微生物的代谢活动。

镰刀菌属真菌在续断药材发汗后相对丰度明显增加，其对应菌属的真菌J35菌丝体制备的诱导子能显著提高川续断无菌苗根中川续断皂苷Ⅵ的含量，而其本身并不产生川续断皂苷Ⅵ，表明J35可能是作为一个诱导因子通过调节或激活信号传导途径中与川续断皂苷Ⅵ合成相关酶的表达，从而影响川续断皂苷Ⅵ的合成和积累，这个过程可能还涉及茉莉酸、水杨酸、一氧化氮以及活性氧等信号分子。胡正平等通过茉莉酸甲酯（MeJA）处理川续断的研究表明，MeJA可通过上调川续断皂苷Ⅵ合成关键酶基因的表达来促进川续断皂苷Ⅵ的积累，进一步表明茉莉酸在促进川续断皂苷Ⅵ积累中的作用。课题组后续将继续探讨J35促进川续断皂苷Ⅵ积累的机制，研究续断发汗过程影响三萜皂苷类成分变化的机制，为揭示中药材发汗加工的科学内涵奠定理论基础。