Box-Behnken设计-响应面法优化木瓜标准汤剂的制备工艺

2022-03-30聂淞莹唐海明汪鋆植王丹阳颜华玲胡浩宁黄永梅三峡大学生物与制药学院湖北宜昌443000湖北恒安芙林药业股份有限公司湖北宜昌44303

中南药学 2022年2期

聂淞莹，唐海明，汪鋆植*，王丹阳，颜华玲，胡浩宁，黄永梅（. 三峡大学生物与制药学院，湖北宜昌 443000；. 湖北恒安芙林药业股份有限公司，湖北宜昌 44303）

木瓜又名“皱皮木瓜”“铁脚梨”，为蔷薇科植物贴梗海棠[

Chaenomeles speciosa

（Sweet）Nakai]的干燥近成熟的果实，具有舒筋活络、和胃化湿的作用，主要化学成分为三萜类、苯丙素类、黄酮类、有机酸类等。其具有镇痛、抗炎、增强免疫、保肝、抗胃溃疡与肠损伤、抗肿瘤等药理活性。中药饮片标准汤剂是基于中医理论和临床用药，参考现代提取方法，经标准化工艺制备而成的单味中药饮片水煎剂。由于中药材成分复杂，且受产地、区域、气候、环境、加工方式的影响，传统汤剂制备工艺很难保证临床疗效的一致性和制备工艺的合理性。因此，本文采用多指标层次分析法（AHP）计算各指标权重，并结合Box-Behnken响应面法优化木瓜标准汤剂的制备工艺参数，旨在为木瓜标准汤剂的制备提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Thermo Ultimate 3000型高效液相色谱系统（包括高压输液系统、二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、紫外可见光检测器、数据处理系统，赛默飞科技有限公司）；RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；TD24K离心机（湖北湘仪仪器公司），PB-10型pH计（德国赛多利斯公司）；XSE205DU型十万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），ME204T/02型万分之一天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），DTC-27型数控超声波清洗器（湖北鼎泰高科有限公司）。

1.2 试药

绿原酸（批号：110753-202018，含量：96.1%）、原儿茶酸（批号：110809-201906，含量：97.7%）、

-苹果酸（批号：190014-201302，含量：100%）（对照品，中国食品药品检定研究院）；莽草酸（批号：C11015240）、奎尼酸（批号：C11520221）（对照品，含量≥98%，上海麦克林生化科技有限公司）；木瓜药材购自湖北宜昌市长阳土家族自治县，经三峡大学王玉兵教授鉴定为贴梗海棠的干燥近成熟果实，符合2020年版《中国药典》一部要求。乙腈为色谱纯（湖北弗顿生化科技有限公司）；乙醇为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；磷酸为分析纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；水为超纯水（经Milli-Q Reference系统净化），其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 各成分含量测定

2.1.1 色谱条件采用Agilent ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；流动相乙腈（A）-0.01%磷酸水（B），梯度洗脱（0～8 min，1%A；8～15 min，1%～8%A；15～25 min，8%～10%A；25～35 min，10%～15%A；35～40 min，15%A；40～45 min，15%～1%A；45～55 min，1%A）；检测波长0～8 min：212 nm；9～55 min：280 nm；流速0.8 mL·min；柱温30℃；进样量10 μL。色谱图见图1。

图1 混合对照品溶液（A）及木瓜提取样品溶液（B）的HPLC色谱图Fig 1 HPLC chromatogram of mixed reference substance（A）and extracted C. speciosa sample（B）

2.1.2 对照品溶液制备分别精密称取各对照品适量，用流动相B溶解，制成质量浓度分别为绿原酸99.5 μg·mL、原儿茶酸18.5 μg·mL、

-苹果酸 1940.0 μg·mL、莽草酸536 .0 μg·mL、莽草酸4176.0 μg·mL的储备液，各精密吸取适量，用流动相B稀释，即得各质量浓度分别为40.3、9.3、194.0、106.2、208.8 μg·mL的对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液制备精密吸取木瓜水煎液10 mL，置于50 mL量瓶中，无水乙醇定容至刻度，醇沉2 h，4000 r·min离心5 min，精密吸取上清液5 mL，蒸干，残渣加入流动相B溶液溶解，定容至10 mL，摇匀，即得，置于4℃冰箱中保存。

2.1.4 线性关系考察精密吸取“2.1.2”项下对照品储备液适量，流动相B溶液配制成6种系列质量浓度的溶液，各进样10 μL测定。以质量浓度为横坐标（

），峰面积为纵坐标（

）进行回归，结果见表1。

表1 各成分线性关系
Tab 1 Linearity of various constituents

成分回归方程 r 线性范围/（μg·mL －1）绿原酸 Y＝0.3288x－0.3177 0.9998 9.9～99.5原儿茶酸 Y＝0.3303x－0.0105 0.9999 0.925～18.5 L-苹果酸 Y＝0.0082x－0.0381 0.9996 97～1940莽草酸 Y＝0.4993x＋0.3606 0.9999 26.8～536奎尼酸 Y＝0.0053x－0.1515 0.9997 208.8～4176

2.1.5 精密度试验精密吸取对照品溶液10 μL，连续进样6次，测得绿原酸、原儿茶酸、

-苹果酸、奎尼酸、莽草酸峰面积的

RSD

分别为0.71%、1.4%、1.2%、0.16%、1.6%，表明仪器精密度良好。2.1.6 重复性试验取同一制备工艺下的标准汤剂，按“2.1.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，进样测定，测得绿原酸、原儿茶酸、

-苹果酸、奎尼酸、莽草酸峰面积的

RSD

分别为0.94%、1.6%、1.9%、0.62%、1.0%，表明该方法重复性良好。2.1.7 稳定性试验取同一份供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进样测定，测得绿原酸、原儿茶酸、

-苹果酸、奎尼酸、莽草酸峰面积

RSD

分别为1.2%、0.95%、0.78%、1.4%、1.3%，表明溶液在24 h内稳定性良好。2.1.8 加样回收试验精密吸取供试品溶液5 mL，共6份，精密加入对照品溶液适量，进样测定，计算回收率。结果绿原酸、原儿茶酸、

-苹果酸、奎尼酸、莽草酸平均加样回收率分别为96.9%、98.2%、98.6%、99.5%、99.5%，

RSD

分别为2.5%、1.8%、1.9%、0.86%、1.6%。

2.2 单因素试验

精密称取木瓜饮片100 g，加入水浸泡45 min，考察加水量（6、7、8、9、10倍）、煎煮时间（20、30、40、50、60 min）、煎煮次数（1、2、3次）、浓缩温度（50、60、70、80℃）等因素，以绿原酸、原儿茶酸、

-苹果酸、奎尼酸、莽草酸含量以及出膏率为指标，通过单因素控制变量法，绘制含量动态分布趋势图和出膏率动态图，结果见图2。根据试验结果，考虑实际操作，选择加水量8倍、煎煮30 min、煎煮2次作为响应面法的考察水平。

图2 各成分含量及出膏率动态分布趋势Fig 2 Dynamic distribution trends for various constituents content and dry extract rate

2.3 层次分析法计算权重

经测定，木瓜水煎液中主要含有绿原酸、原儿茶酸、莽草酸、

-苹果酸、奎尼酸等有机酸。根据木瓜标准汤剂药理、药效作用强弱、各成分含量并结合文献将权重指标予以量化。即将6个指标分为4个层次，并确定指标的优先顺序：出膏率＞绿原酸＞原儿茶酸＞

-苹果酸＝奎尼酸＝莽草酸，据此进行成对比较，构建优先判断矩阵，得到相对评分，结果见表2，发现

＜0.1，表明矩阵符合一致性检验，权重系数合理有效。综合评分

＝0.2519×绿原酸含量＋0.1243×原儿茶酸含量＋0.0519×奎尼酸含量＋0.0519×莽草酸含量＋0.0519×

-苹果酸含量＋0.4682×出膏率。

表2 各指标权重系数
Tab 2 Weight coefficients for various indicators

指标绿原酸原儿茶酸L-苹果酸奎尼酸莽草酸出膏率权重系数 CR绿原酸 1 3 5 5 5 1/3 0.2519 0.0218原儿茶酸 1/3 1 3 3 3 1/5 0.1243苹果酸 1/5 1/3 1 1 1 1/7 0.0519奎尼酸 1/5 1/3 1 1 1 1/7 0.0519莽草酸 1/5 1/3 1 1 1 1/7 0.0519出膏率 3 5 7 7 7 1 0.4682

2.4 响应面法

根据Box-Behnken试验设计原理，综合单因素影响试验结果，以加水量（A）、煎煮时间（B，第二、三煎加水量为第一次加水量－1倍）、煎煮次数（C，第二、三煎煎煮时间为第一次煎煮时间－10 min）为考察因素。设计因素与水平表（见表3）。以绿原酸、原儿茶酸、苹果酸、奎尼酸、莽草酸含量以及出膏率的综合评分为评价指标，响应面法优化制备工艺，结果见表4。

表3 Box-Behnken设计因素与水平表
Tab 3 Factor and level of Box-Behnken design

水平因素A. 加水量/倍 B. 煎煮时间/min C. 煎煮次数/次－1 7 20 1 0 8 30 2 1 9 40 3

表4 响应面试验方案与结果
Tab 4 Design and results of response surface method

序号加水量/倍煎煮时间/min 煎煮次数/次绿原酸/% 原儿茶酸/% 苹果酸/% 奎尼酸/% 莽草酸/% 出膏率/% 综合评分1 9 20 2 0.262 0.0389 7.09 9.83 1.19 42.22 0.2078 2 8 30 2 0.188 0.0396 7.02 10.64 1.24 40.26 0.1988 3 8 30 2 0.243 0.0445 6.77 10.58 1.20 39.18 0.1937 4 7 40 2 0.192 0.0457 7.23 10.81 1.23 37.12 0.1843 5 8 30 2 0.301 0.0428 6.49 11.10 1.24 38.48 0.1907 6 8 30 2 0.285 0.0400 7.25 11.04 1.30 38.66 0.1919 7 9 40 2 0.289 0.0371 7.84 9.18 1.11 44.35 0.2178 8 8 40 1 0.203 0.0377 9.00 10.79 1.32 27.75 0.1414 9 8 30 2 0.297 0.0381 7.50 10.25 1.27 39.18 0.1941 10 7 30 3 0.276 0.0401 6.53 10.45 1.24 43.46 0.2137 11 9 30 3 0.246 0.0451 5.72 10.57 1.20 46.48 0.2274 12 9 30 1 0.305 0.0419 8.14 12.22 1.43 28.58 0.1459 13 7 30 1 0.344 0.0406 7.53 10.66 1.22 24.55 0.1259 14 8 20 1 0.241 0.0364 8.55 10.90 1.36 28.72 0.1459 15 7 20 2 0.284 0.0412 7.20 10.79 1.25 36.18 0.1801 16 8 40 3 0.352 0.0441 7.37 9.78 1.18 48.98 0.2398 17 8 20 3 0.237 0.0390 7.72 9.71 1.21 44.11 0.2168

采用Design-Expert 10.0 软件进行多元线性回归和二项拟合，得到方程为

＝0.19＋0.012

＋4.087×10

＋0.042

＋1.45×10

－1.575×10

＋6.875×10

－2.045×10

＋5.705×10

－0.014

（

＝0.9920），方差分析见表5，可知各因素影响程度依次为C＞A＞B；模型

＜0.0001，表明其达到极显著水平，失拟项不显著

＝0.1356＞0.05，说明模型合适。各因素之间两两交互作用对木瓜标准汤剂制备工艺的影响见图3。可知最优工艺为加8.173倍水煎煮39.919 min，煎煮2.997次，结合实际操作，将其修正为加8倍水煎煮40 min，煎煮3次。

图3 各因素交互作用响应面图和等高线图Fig 3 Response surface and contour plots for interaction between factors

表5 响应面回归模型的方差分析
Tab 5 Variance analysis for the regression model

方差来源平方和自由度均方差 F检验 P值模型 0.017 9 1.856×10－3 96.13 ＜0.0001 A 1.126×10－3 1 1.126×10－3 58.31 0.0001 B 1.337×10－4 1 1.337×10－4 6.92 0.0332 C 0.014 1 0.014 742.25 ＜0.0001 AB 8.410×10－6 1 8.410×10－6 0.44 0.5284 AC 9.922×10－6 1 9.922×10－6 0.51 0.4815 BC 1.891×10－4 1 1.891×10－4 9.79 0.0163 A2 1.761×10－5 1 1.761×10－5 0.91 0.3529 B2 1.370×10－4 1 1.370×10－4 7.10 0.0301 C2 7.753×10－4 1 7.753×10－4 40.16 0.0004残差 1.352×10－4 7 1.931×10－5 －－失拟项 9.684×10－5 3 3.228×10－5 3.37 0.1356纯误差 3.831×10－5 4 9.578×10－6 －－总误差 0.017 16 －－－

根据优化工艺进行3批验证试验，结果显示3份木瓜饮片标准汤剂的综合评分分别为0.230、0.224、0.230，平均值为0.228，

RSD

为1.7%。与预测值0.240较为接近，说明该工艺合理可行。取木瓜饮片适量，按照一般饮片标准汤剂工艺（一煎7倍量水30 min，二煎6倍量水20 min，浓缩至5倍饮片质量）进行煎煮，平行3次，测得6种指标平均值分别为0.192%、0.0457%、7.23%、9.21%、1.18%、36.15%，综合评分为0.179。优化后的木瓜标准汤剂制备工艺综合评分优于一般制备工艺。

3 讨论

3.1 评价指标的确定

指标成分含量、指标成分转移率和出膏率是评价木瓜标准汤剂的重要参数。在指标成分含量方面，2020年版《中国药典》是以齐墩果酸和熊果酸为指标进行质量评价，但该类成分在提取过程中转移率较低，且在水煎液中基本不能溶出，故不太适合作为评价标准汤剂的指标。本研究经前期HPLC色谱定性分析，检测到木瓜水煎液中主要包含水溶性有机酸，如绿原酸、原儿茶酸、

-苹果酸、莽草酸、奎尼酸等。大量研究表明该类成分具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、镇痛、保肝、抗病毒等作用。因此，本研究采用层次分析法对5种有机酸含量和出膏率得到的权重系数进行综合评分。

3.2 有机酸稳定性探讨

在单因素试验中，

-苹果酸、莽草酸、奎尼酸含量随煎煮时间的延长，呈现先增加后降低的变化，其原因是该类成分在20 min内逐渐被提取，但随着时间的延长，脂肪族有机酸受热不稳定，其含量下降。绿原酸在40 min时含量下降，该成分为咖啡酸奎尼酸内酯，在pH 2.0～3.0或3.0～8.0时，能被酸或碱催化发生水解。木瓜标准汤剂pH值介于2.9～3.6，绿原酸在此条件下易水解。且绿原酸含量与受热温度和时间有关，受热温度越高，受热时间越长，绿原酸越易分解。但在本研究中发现，在减压浓缩木瓜标准汤剂时，随温度的增加和时间的延长，绿原酸损失率较少，并且在汤剂浓缩时，保持了浓缩的真空状态，猜测绿原酸含量可能与空气接触有关。后期在制备木瓜标准汤剂的同时，应尽量避免与空气的接触，可采用减压浓缩、抽真空的制备工艺。

3.3 中药饮片标准汤剂探讨

中药饮片标准汤剂一直以来备受关注，标准汤剂中的“标准”主要包括中药材的来源、提取加工的统一性以及质量控制的严谨性，在不同来源、产地和提取加工方式下，其水煎液质量也不尽相同。因此，规范中药饮片的制备工艺成为中药饮片标准汤剂的重点。中药具有多成分、多靶点的特性，水溶性成分并不能完全表征中药的特性。中药标准汤剂是严格以水作为提取溶剂，不能以有机溶剂进行提取，这就限制了脂溶性成分在标准汤剂中的溶出。而目前研究的中药标准汤剂不光是单一的中药饮片，还延伸出了各种中药炮制品的标准汤剂、中药煮散以及复方标准汤剂，后续关于标准汤剂的研制是否会以醇提和水提混合制备的方式还不得而知。随着现代科技的进步，标准汤剂的制备工艺也在不断完善，不仅能为其配方颗粒提供标准化的制备方案，还能为其临床应用和相关新剂型提供理论基础。