张蓓，何浩，吴海智，胡艳君，石鹏途

（湖南省产商品质量检验研究院，长沙 410007）

0 引言

亚硝酸盐不仅广泛存在于环境中，还常常被用于食品中作为护色剂或防腐剂使用[1]，但被怀疑对人类健康有潜在影响，还可致癌[2-5]。根据GB10765-2010等国家强制性标准规定[6-9]，婴幼儿奶粉和米粉中亚硝酸盐（以NaNO2计）含量不得超过2 mg/kg。目前国内外定量测定食品中亚硝酸盐的方法主要有分光光度法[10-13]、色谱法[1,14-24]、快速检测法[12,25-26]等，但适用于以婴幼儿奶粉和米粉为基质的测定方法并不多，现行检验依据GB 5009.33-2016中离子色谱法和分光光度法均有一定的局限性[27]。因此，开发一种简单、高效、低限的亚硝酸盐检测方法十分必要。本实验拟探究并优化顶空-气相色谱法检测特定基质中亚硝酸盐的准确定量方法，为快速检测婴幼儿配方食品和婴幼儿谷类辅助食品中亚硝酸盐提供新思路和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

亚硝酸钠（分析纯）、四硼酸钠（硼砂）（分析纯）、亚铁氰化钾（分析纯）、二水乙酸锌（分析纯）、国药集团化学试剂有限公司；环己基氨基磺酸钠（99%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；浓硫酸（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；DB-1石英毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25μm），美国安捷伦科技有限公司；高纯氮气（纯度≥99.999%）、高纯氢气（纯度≥99.999%）、高纯空气（纯度≥99.999%），长沙日臻气体有限公司；实验所用婴幼儿奶粉和米粉样品均为市售。

1.2 仪器与设备

HS-20顶空进样器、Nexis GC-2030气相色谱仪，日本岛津公司；BSA224S-CW电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；SQP SECURA225D-1CN电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

顶空参数：恒温炉温度50.0℃，样品流路温度90.0℃，传输线温度150.0℃，GC循环时间13 min，样品瓶恒温时间30 min，定量阀体积1.0 mL。

柱温升温程序：初温80℃保持1 min，40℃/min升温至100℃保持2 min，40℃/min升温至240℃保持2 min，共9 min。

进样口：气化室150℃，进样量1 mL，色谱柱流量2.0 mL/min，分流比20∶1。

检测器：氢火焰离子化检测器（FID），温度300℃。

载气：高纯氮气，流量30 mL/min，尾吹24 mL/min。

氢气：32 mL/min；空气：200 mL/min。

1.3.2 试剂配制

饱和硼砂溶液（质量浓度50 g/L）：称取5.0 g硼酸钠，溶于100 mL热水中，冷却后备用。

环己基氨基磺酸钠溶液（质量浓度10 mg/m L）：称取5.0 g环己基氨基磺酸钠，用水溶解，并稀释至500 m L。

硫酸溶液（质量浓度100 g/L）：量取27 mL浓硫酸小心缓缓加入400 mL水中，后加水至500 mL。

亚铁氰化钾溶液（质量浓度106 g/L）：称取106.0 g亚铁氰化钾，用水溶解，并稀释至1000 mL。

乙酸锌溶液（质量浓度220 g/L）：称取220.0 g乙酸锌，先加30 mL冰乙酸溶解，用水稀释至1000 m L。

1.3.3 标准溶液的配制

标准品：亚硝酸根离子标准溶液（以亚硝酸根离子NO2-计，质量浓度1 000μg/mL），具有标准物质证书。用水稀释配制成质量浓度为250.0μg/mL的亚硝酸钠标准储备液，置于1～4℃冰箱保存，可保存2个月。用水将亚硝酸钠标准储备溶液逐级稀释成质量浓度为5.0，0.5，0.05μg/mL的亚硝酸钠标准使用液，标准使用液现配现用。

标准工作液1～7：分别准确移取质量浓度为0.05 μg/mL的亚硝酸钠标准使用液0.10，0.20，0.50，1.00，5.00 mL于顶空瓶中；补齐水至5.0 mL，此为标准工作液1～5；分别准确移取质量浓度为0.5μg/mL的亚硝酸钠标准使用液1.00 mL和2.00 mL于顶空瓶中，补齐水至5.0 mL，此为标准工作液6～7。再向标准工作液1～7分别加入1.0 mL环己基氨基磺酸钠溶液（质量浓度10 mg/mL），用手轻微摇匀后，再分别加入1.0 m L硫酸溶液（质量浓度100 g/L），迅速压紧瓶盖，并保持顶空进样瓶直立，在水平桌面上做快速的圆周转动，使物质充分混合（转动过程中溶液不能接触到密封垫，如果有接触，需重新配制）。标准工作液1～7现用现配，待上机分析。

1.3.4 样品前处理

称取1.25 g（精确至0.0001 g）婴幼儿配方食品和辅助食品样品于25 m L比色管中，加入1.5 m L饱和硼砂溶液（质量浓度50 g/L），混匀，再加入17.5 mL水，超声30 min。（或者再加入17.5 mL 40℃左右的温水，40℃水浴15 min，然后冷却至室温。）向溶液中加入0.5 mL亚铁氰化钾（质量浓度106 g/L），混匀，再加入0.5 mL乙酸锌溶液（质量浓度220 g/L），混匀，用水定容至刻度，混匀后静置20 min。用定性滤纸过滤，混匀，然后吸取滤液5.0 mL至顶空瓶中，加入1.0 m L环己基氨基磺酸钠溶液（质量浓度10 mg/m L），用手轻微摇匀后，再加入1.0 mL硫酸溶液（100 g/L），迅速压紧瓶盖，并保持顶空进样瓶直立，在水平桌面上做快速的圆周转动，使物质充分混合（转动过程中溶液不能接触到密封垫，如果有接触，需重新配制），待上机分析。

1.3.5 数据处理

图谱的采集采用岛津LabSolutions软件（版本5.98），实验数据采用Ori ginPro 8.5软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

本研究采用顶空-气相色谱法对婴幼儿配方食品和辅助食品样品中亚硝酸盐含量进行测定，因此气相部分和顶空部分参数对实验结果起到关键作用。设定气相部分参数：柱温升温程序按照初温80℃保持1 min，40℃/min升温至100℃保持2 min，40℃/min升温至240℃保持2 min，共9 min。进样口气化室温度为150℃，色谱柱流量为2.0 mL/min，分流比为20∶1。氢火焰离子化检测器（FID）温度300℃；设定顶空部分参数：恒温炉温度为50.0℃，样品流路温度为90.0℃，传输线温度为150.0℃，样品瓶恒温时间30 min。采用该色谱条件对亚硝酸盐有良好的保留作用，可以使目标物质亚硝酸盐衍生产物环己烯[1]得到有效分离，亚硝酸盐衍生产物环己烯的保留时间为1.77 min，获得的峰形正常且分离度较好，可以对其进行定量分析。1.0μg亚硝酸盐标准物质和样品中亚硝酸盐的气相色谱图分别如图1和图2所示。

图1 1.0μg亚硝酸盐标准物质气相色谱

图2 婴幼儿配方食品和辅助食品样品中亚硝酸盐气相色谱

2.2 前处理方法优化

本研究比较了同一个样品分别在常温超声30 min和40℃水浴15 min的条件下提取时的亚硝酸盐加标回收率，以不同样品为横坐标，亚硝酸盐的加标回收率为纵坐标，结果如图3所示。两种前处理方式均可将亚硝酸盐提取出来，加标回收率并无显著性差异，均落在90%～120%的范围内，考虑到前处理操作的简便性以及实验结果稳定性，因此，本研究选择在常温超声30 min的条件下进行提取。

图3 不同前处理条件下加标回收率对比实验

2.3 线性范围与检出限

分别配制终质量浓度为0.001，0.002，0.005，0.01，0.05，0.1，0.2μg/mL的亚硝酸盐标准溶液，经衍生化处理后，进行上机测定，结果发现各浓度目标峰与该浓度呈现线性相关，见图4。以亚硝酸钠进样量（μg）为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，确定线性方程与线性相关系数，标准曲线见图5。随同做空白实验，实验结果扣除实验用水中本身含有的微量亚硝酸盐。结果表明，亚硝酸盐的标准曲线线性方程为y=11857.2x+219.094，R2为0.9997，在浓度范围内线性良好。以S/N=3作为检出限，结果表明，本研究方法检出限为0.03 mg/kg，优于GB 5009.33-2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的检出限（0.5 mg/kg）[27]。取样量为1.25 g时，对应的检测范围为0.03～18.58 mg/kg。

图4 亚硝酸盐标准物质浓度依赖性曲线

图5 亚硝酸盐标准物质标准曲线（以NaNO2计）

2.4 精密度

分别选取低、中、高3个质量浓度的亚硝酸盐标准溶液，按样品前处理步骤衍生化处理后上机分析，重复6次实验，计算相对标准偏差（RSD），测定结果见表1。结果显示，亚硝酸盐的精密度在1.05%～5.98%之间，具有良好的精密度和准确性。

表1 测定亚硝酸盐方法的精密度（n=6）

2.5 样品加标回收率

称取同一种婴幼儿配方食品和辅助食品样品作三水平加标回收实验，分别向其中加入0.125μg、2.50μg、12.5μg亚硝酸盐标准物质，按照样品前处理步骤衍生处理后，平行测定6次，计算加标回收率和相对标准偏差（RSD），结果见表2。亚硝酸盐的加标回收率在94.37%～104.14%之间，相对标准偏差（RSD）均小于9.03%。均满足GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的要求[28]。

表2 婴幼儿配方食品和辅助食品中亚硝酸盐的加标回收率和相对标准偏差（n=6）

（续表2）

2.6 实际样品的测定

采用本研究方法对9种市售婴幼儿配方食品和辅助食品样品进行检测（结果以重复性条件下获得的3次独立测定结果的平均值表示），其中5个样品均未检出亚硝酸盐，4个样品均检出亚硝酸盐，质量分数在0.544～1.570 mg/kg之间，具体含量见表3。

表3 婴幼儿配方食品和辅助食品样品中亚硝酸盐的质量分数（n=3） mg/kg

3 结果与讨论

本研究采用超声辅助衍生最大限度地提取了婴幼儿配方食品和辅助食品中的亚硝酸盐，并实现了利用顶空-气相色谱法对亚硝酸盐进行准确定量测定。本实验对前处理步骤进行了优化，并比较了不同因素对加标回收率的影响。结果表明，亚硝酸盐可在1.7 min左右实现有效分离，并且在浓度范围内标准物质曲线线性良好，R2为0.9997。取样量为1.25 g时，对应的检测范围为0.03～18.58 mg/kg。该方法检出限为0.03 mg/kg，精密度在1.05%～5.98%之间。在常温超声30 min的条件下婴幼儿配方食品和辅助食品样品中亚硝酸盐提取最充分，加标回收率在94.37%～104.14%之间，相对标准偏差（RSD）均低于9.03%。该方法操作简便，稳定性好，检出限低，线性范围宽，重复性和回收率好，是快速检测婴幼儿奶粉和米粉中亚硝酸盐较好的方法。