龚英， 聂森， 谭雪， 钟金凤， 陶雪， 晏匀清， 张婉嫕， 陈继平

(云南师范大学 化学化工学院，云南 昆明 650500)

番石榴是一种原产美洲的热带水果，通过引种传播后，现已广泛分布在全球热带和亚热带地区，在我国南方很多省区均有分布[1-5].由于从栽培区逃逸，四川攀枝花市和云南丽江华坪县现有大量野生番石榴(图1)[6].野生番石榴果实呈球形，幼果外皮为青色，成熟时外皮为金黄色，果肉为红色，果籽为黄色.

图1 野生番石榴及未成熟青果的切片

番石榴果实的季节性强，外皮非常薄，不耐储存，极易变质.研究证实，即使采用气调包装番石榴全果[7]、用生物膜包覆番石榴全果[8-11]、切片[12]或利用超声波辅助干燥番石榴切片[5,13]都仅仅能短暂延长番石榴的保存期，并不能从根本上克服番石榴水果的季节特性，这严重影响对其进一步开发利用.

番石榴全身是宝，具有较高的营养价值和药用价值.番石榴叶富含多糖、多酚和黄酮类活性物质，具有抗氧化和抗糖化[14-18]、抗真菌[19]、抑制细菌[20]、治疗急性传染性腹泻[21]、抗炎[22]及抗癌[3,23]等作用.番石榴果实也含有类似的活性物质，具有一定的药用价值.郭开平等人研究发现从番石榴果实中提取的多糖能显著降低糖尿病小鼠的血糖水平[24].据广东省中药标准(第一册)收载，未成熟番石榴幼果的果汁具有降血糖作用[25].此外，番石榴中多酚和黄酮等活性成分具有抗氧化作用[26-27].因此如何高效提取番石榴果实中多糖、多酚和黄酮三类活性组分，成为番石榴功能性食品开发的关键问题.以云南野生番石榴未成熟青果为原料，拟采用表面活性剂辅助水提法提取多糖、多酚和黄酮三类活性组分.先通过单因素实验对三组分的提取工艺条件进行初步筛选，再通过正交试验进一步优化提取条件，以期为云南野生番石榴的功能性食品开发提供一定的依据.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

野生番石榴未成熟青果采自云南省丽江市华坪县，采集时间为2021年6月.将青果切成各边长度为3～5 mm的方块，自然晾干，备用.

标准品没食子酸的纯度为99%，芦丁的纯度为95%，均购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；标准品D(+)-无水葡萄糖的纯度为99%，购买于上海国药集团化学试剂有限公司；十二烷基硫酸钠(SDS)为分析纯，购买于上海国药集团化学试剂有限公司；钨酸钠、磷钼酸、碳酸钠、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、蒽酮、浓硫酸和磷酸为常规化学试剂，均为分析纯.

电子天平(型号PR224ZH/E，奥豪斯仪器(常州)有限公司)；恒温振荡器(型号SHZ-82，常州国华电器有限公司)；紫外可见分光光度计(型号UV-1800，上海美谱达仪器有限公司).

1.2 实验方法

1.2.1 提取操作简介

称取一定量的番石榴原料，按比例加入预先调整好SDS浓度和pH值的蒸馏水，在规定的温度条件下，振荡提取至适当时间后，过滤得提取液.

1.2.2 单因素实验

按照1.2.1所述实验方法，以干的番石榴青果为原料，设计料液比(1∶8、1∶10、1∶12，质量比)、单次提取时间(2 h、3 h、4 h)、提取次数(1次、2次、3次)、振荡速度(30 r/min、60 r/min、90 r/min)、SDS浓度(0、0.2%、0.4%，质量分数)、提取pH值(5、7、9)、提取温度(15 ℃、30 ℃、45 ℃)七组单因素实验，研究七个因素对多糖、多酚和黄酮三种活性组分提取量的影响.在单因素实验中，除要考察的那个因素外，其余因素均固定为中间值水平.

1.2.3 正交试验

根据上述单因素实验结果，选取影响最大的4个因素，设计四因素三水平正交试验，进一步优化提取条件.正交试验设计中未考查的3个因素，取单因素实验确定的水平.

1.2.4 提取液的分析

多糖含量的测定：以葡萄糖为标准品，采用蒽酮-硫酸溶液显色法，测定番石榴提取液中多糖含量.然后，依据提取过程的料液比，计算出番石榴青果多糖提取量.

多酚含量的测定：以没食子酸为标准品，采用Folin-酚法，测定番石榴提取液中多酚含量.然后，依据提取过程的料液比，计算出番石榴青果多酚提取量.

黄酮含量的测定：以芦丁为标准品，采用离子络合法，测定番石榴提取液中黄酮含量.然后，依据提取过程的料液比，计算出番石榴青果黄酮提取量.

1.3 数据处理

每组实验平行测定3次，采用OriginPro 8 SR3软件进行数据统计，求得平均值和标准偏差，并进行绘图.在正交试验中，分别取多糖、多酚和黄酮提取量的平均值，利用正交助手软件，采用极差法，分析各因素对三组分提取量的影响，并优化提取条件.

2 实验结果

2.1 单因素实验结果

2.1.1 料液比对三组分提取量的影响

料液比是指番石榴原料与提取溶液的质量比.料液比对番石榴青果中多糖、多酚和黄酮三种活性组分提取量的影响如图2所示.由图2可知，随着料液比增加，三组分的提取量呈明显上升趋势.当料液比由1∶8提高到1∶10时，多糖、多酚和黄酮的提取量分别增加了25.0%、21.0%和14.4%，但是当料液比从1∶10提高到1∶12时，三组分提取量增长幅度明显变小，分别为2.0%、1.3%和5.3%.在保证提取量的前提下，从降低提取用水量考虑，可将料液比固定为1∶10.

图2 料液比对三组分提取量的影响

2.1.2 单次提取时间对三组分提取量的影响

单次提取时间对番石榴青果中多糖、多酚和黄酮提取量的影响如图3所示.由图3可知，随着单次提取时间增加，三组分的提取量呈明显上升趋势.当单次提取时间从2 h延长至3 h时，多糖、多酚和黄酮的提取量分别增加了16.2%、17.9%和6.8%，但是当单次提取时间从3 h延长到4 h时，三组分提取量的增长幅度降低，分别为5.1%、4.4%和3.3%.这是因为初始时随着提取时间的增加，番石榴固体原料中三种活性组分溶出量增加，并不断向溶液中转移，从而提高提取量.但当提取溶液与番石榴原料中三组分浓度达到平衡时，继续延长提取时间对于提取量影响变小.因此，从缩短提取时间考虑，可将单次提取时间固定为3 h.

图3 提取时间对三组分提取量的影响

2.1.3 提取次数对三组分提取量的影响

提取次数对番石榴青果中多糖、多酚和黄酮三种活性组分提取量的影响如图4所示.由图4可知，随着提取次数增加，三组分的提取量呈上升趋势.当提取次数从1次增加到2次时，多糖、多酚和黄酮的提取量分别增加了69.7%、60.2%和42.5%，但是当提取次数增加到3次时，三组分提取量仅分别增加了16.8%、15.8%和7.0%.因此，从简化提取流程考虑，可将提取次数固定为2次.

图4 提取次数对三组分提取量的影响

2.1.4 振荡速度对三组分提取量的影响

振荡速度对番石榴青果中多糖、多酚和黄酮三种活性组分提取量的影响如图5所示.由图5可知，随着振荡速度增加，三组分的提取量仅略微上升.当振荡速度从30 r/min提高到60 r/min时，多糖、多酚和黄酮的提取量分别增加了3.4%、7.4%和7.9%；当振荡速度从60 r/min提高到90 r/min，三组分的提取量分别增加了1.9%、0.5%和3.9%.提高振荡速度，有助于水分子在提取溶液与番石榴原料中运动交换，从而加速三组分的溶出.但是，当振荡速度提高到一定量时，水分子运动对于组分溶出的影响变小.因此，从降低能耗考虑，可将振荡速度固定为60 r/min.

图5 振荡速度对三组分提取量的影响

2.1.5 SDS浓度对三组分提取量的影响

表面活性剂SDS浓度对番石榴青果中多糖、多酚和黄酮三种活性组分提取量的影响如图6所示.由图6可知，加入0.2%SDS后，多糖、多酚和黄酮三组分的提取量显著增加，增长幅度分别为43.7%、65.9%和52.6%.当SDS浓度从0.2%提高到0.4%时，三组分提取量的增长量变小，增长幅度分别为3.9%、3.8%和5.6%.25 ℃时，SDS的临界胶束浓度(CMC)为0.008 mol/L，即质量浓度为0.2%.当SDS浓度达到CMC时，溶液中会形成大量的胶束，可将三组分增溶于胶束内核，从而增强三组分的溶解和提取.当SDS浓度进一步增高到0.4%时，溶液中胶束量会进一步增加，但是当三组分在番石榴原料和溶液中浓度达到平衡时，SDS胶束浓度对于提取量影响较小.基于此，从降低物质消耗考虑，可将表面活性剂浓度固定为0.2%.

图6 SDS浓度对三组分提取量的影响

2.1.6 提取pH值对三组分提取量的影响

提取pH值对番石榴青果中多糖、多酚和黄酮三种活性组分提取量的影响如图7所示.由图7可知，不同pH值时三组分的提取量显著不同.总体而言，在酸性和碱性条件下，三组分提取量均高于中性条件.这是因为在酸性或碱性条件下，多糖、多酚和黄酮三组分能够发生离解，以增加其水溶性，从而提高提取量.此外，当pH值为5时，三组分的提取量均略高于pH值为9时.因此，可以采用酸提法促进三组分的提取，即将提取液的pH值调整为5.

图7 提取pH值对三组分提取量的影响

2.1.7 提取温度对三组分提取量的影响

提取温度对番石榴青果中多糖、多酚和黄酮三种活性组分提取量的影响如图8所示.由图8可知，随着提取温度增加，三组分的提取量呈明显上升趋势.当提取温度从15 ℃提高到30 ℃时，多糖、多酚和黄酮的提取量分别增加了7.4%、7.5%和11.2%；当提取温度继续提高到45 ℃时，三组分的提取量进一步提高，增加量分别为11.4%、9.7%和19.1%.随着提取温度的升高，水分子在提取溶液与番石榴原料中运动交换速度加快，从而加速三组分的溶出，提高提取量.

图8 提取温度对三组分提取量的影响

考虑到昆明地区水沸腾温度在94 ℃左右，前期预备实验考查了90、75、60、45 ℃和15 ℃五个温度条件下三组分的提取量，发现温度≥60 ℃时，三组分的提取量明显低于45 ℃，因此，实验中温度因素仅展示了15、30 ℃和45℃三个条件的提取结果.其原因可能为：多糖是一类由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，多酚是一类具有多元酚结构的次生代谢物，黄酮类物质是由两个具有酚羟基的苯环(A-与B-环)通过中央三碳原子相互联结而成的一系列化合物，这三类组分的化学结构在高温下不稳定，易被氧化破坏，导致较高温度条件下的提取量更低.因此，根据单因素实验结果，可将提取温度设定为45 ℃.

2.1.8 单因素实验结果的分析

综合上述单因素实验研究发现，在番石榴未成熟青果中，多糖含量最高，其次是黄酮，最少的是多酚.根据各因素水平改变后多糖、多酚和黄酮提取量的变化值，综合能耗、物质消耗及时间成本等，由单因素实验初步筛选的各因素水平如下：料液比为1∶10，单次提取时间为3 h，提取次数为2次，振荡速度为60 r/min，SDS浓度为0.2%，提取pH值为5，提取温度为45 ℃.经实验测定，在此条件下，多糖、多酚和黄酮的提取量分别为(246.68±4.58)mg/g、(24.78±0.79)mg/g和(73.63±1.27)mg/g，略高于前面展示的所有单因素实验的最大提取结果.

基于单因素实验的提取结果，进一步计算得到七个因素对三组分提取量的影响如表1所示.根据三组分总的变化幅度数值的高低，七个因素的影响大小次序为提取次数、SDS浓度、料液比、提取温度、单次提取时间、提取pH值和振荡速度.选取影响最大的前4个因素，设计正交试验如表2所示，分析9个实验中多糖、多酚和黄酮提取量.在正交试验中，其余三个因素的水平按照单因素实验结果确定如下：单次提取时间为3 h，提取pH值为5，振荡速度为60 r/min.

表1 七个因素对三组分提取量的影响大小

当提取pH值改变时，三组分提取量的变化幅度取绝对值；总变化量为多糖、多酚和黄酮提取量的变化幅度之和.

表2 正交试验设计

正交试验因素的排列顺序按照单因素实验的开展顺序列举.

2.2 正交试验结果

正交试验中多糖、多酚和黄酮的提取量测定结果分别如表3、表4和表5所示.表中3种活性物质的提取量为3次测定结果的平均，然后进一步利用提取量的平均值进行极差分析.考查的四个因素对多糖、多酚和黄酮提取量的影响大小次序均为提取次数(B)>SDS浓度(C)>料液比(A)>提取温度(D)，这个影响规律与单因素实验的结论是一致的.对于考查的4个因素，优选的实验组合为A3B3C3D3.在此优选条件下，多糖、多酚和黄酮的提取量分别为(289.27±5.15)mg/g、(41.09±0.91)mg/g和(88.55±1.19)mg/g，此结果略高于9个正交试验的提取量结果.相对于单因素实验初步筛选确定出来的提取条件，在正交试验优化的条件中，料液比更大，为1∶12；提取次数更多，为3次，SDS浓度更高，为0.4%；因此，在正交试验优选条件下，三组分提取量略高于单因素实验的优选条件.

表3 正交试验中多糖提取量

表4 正交试验中多酚提取量

表5 正交试验中黄酮提取量

综上所述，为进一步提高三组分的提取量，根据正交试验结果，可将番石榴未成熟青果中多糖、多酚和黄酮的提取条件优选确定如下：料液比为1∶12，单次提取时间为3 h，提取次数为3次，振荡速度为60 r/min，SDS浓度为0.4%，提取pH值为5，提取温度为45 ℃.

3 讨论

产地对于番石榴果实的组分含量具有重要影响，例如采摘于广东省湛江市河唇镇的珍珠番石榴果干粉中多糖含量为56.8 mg/g，多酚含量为1.81 mg/g，黄酮含量为1.94 mg/g[28]；泰国产三种常见番石榴鲜果中多酚含量为0.32～1.15 mg/g、黄酮含量为0.36～3.18 mg/g[3].此外，提取方法不同，番石榴果实中活性组分的提取量也会存在明显差异.例如，邝高波利用微波辅助提取广东湛江产的番石榴，发现多酚的提取量为(1.78±0.38)mg/g[26]，而曹增梅等人利用超声波辅助提取广东湛江产的番石榴，发现多酚的提取量为4.65 mg/g[27]；以80%丙酮为提取溶剂，华南地区红心番石榴鲜果的果皮和果肉提取物中多酚含量分别为10.80 mg/g和4.48 mg/g，黄酮含量分别为5.05 mg/g和2.13 mg/g[29].

对比文献资料发现：(1)云南省华坪县野生番石榴青果中多糖、多酚和黄酮活性组分含量明显高于其他地区的栽培品种.多糖、多酚和黄酮是番石榴果实中已经证实的生理活性组分，说明云南野生番石榴提取物具有药食两用价值，有进一步开发利用的潜力.(2)研究以水为提取溶剂，利用符合药用安全的低浓度的表面活性剂SDS(《中国药典》(2020版))为助溶剂，能同时增强水溶性多糖、多酚和黄酮这三种组分的提取溶出，为赋予番石榴多功能特性提供物质基础，此方法能克服有机溶剂的毒性问题，具有安全高效的特点.

4 结语

以多糖、多酚和黄酮三组分提取量为指标，经单因素实验对云南野生番石榴未成熟青果中三组分的提取工艺条件进行初步筛选.再通过正交试验进一步优化提取条件.在7个实验因素中，对三组分提取量影响最大的两个因素是提取次数和表面活性剂SDS浓度.下一步将会考虑将野生番石榴提取液制备成固体产品，从而延长番石榴的保存期，丰富番石榴产品的种类.