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3-(3,5-二甲氧基苯乙烯基)苯酚的合成及抗肿瘤活性研究

2022-03-26仝红娟高艳蓉唐文强

化学与生物工程 2022年3期
关键词:苯乙烯甲氧基苯酚

仝红娟,高艳蓉,唐文强,刘 斌

(1.陕西国际商贸学院医药学院,陕西 西安 712046;2.陕西省中药绿色制造技术协同创新中心, 陕西 西安 712046)

天然药物是新药的主要来源途径之一[1],其在人类疾病的预防、治疗等方面发挥着巨大的作用。白藜芦醇(resveratrol),化学名3,5,4′-三羟基二苯乙烯,是一类具有二苯乙烯结构的天然非黄酮类多酚化合物[2-3],具有多种生物活性,如抗氧化[4]、抗癌[5]、抗炎[6]、降糖[7]等,但由于半衰期短、靶点多、水溶性差和生物利用度低等不足,其应用受到了很大限制[8]。因此,开发结构新颖、活性优异的白藜芦醇衍生物已成为新药研究的一个重要领域。为了进一步提高白藜芦醇的生物活性、改善其理化性能,近年来,科研人员对白藜芦醇开展了大量的结构修饰研究,以期获得高活性的白藜芦醇衍生物[9-11]。例如,在2020年,Bosquesi等[12]将呋咱氮氧化物通过酯化反应引入到白藜芦醇的酚羟基上,构建了一系列新型的含有呋咱氮氧基团的白藜芦醇衍生物,这类化合物可以通过释放一氧化氮对镰状细胞类疾病有良好的治疗效果。

作者以3-甲氧基苄基磷酸二乙酯(Ⅰ)为原料,经过三溴化硼脱甲基得到中间体3-羟基苄基磷酸二乙酯(Ⅱ),随后在甲醇钠的催化下与3,5-二甲氧基苯甲醛(Ⅲ)发生Wittig-Horner反应得到一个白藜芦醇衍生物3-(3,5-二甲氧基苯乙烯基)苯酚(Ⅳ),通过核磁共振氢谱对其结构进行表征,优化反应条件,并评价3-(3,5-二甲氧基苯乙烯基)苯酚对肿瘤细胞MCF-7、PC-3、HeLa和HepG2的抑制活性。3-(3,5-二甲氧基苯乙烯基)苯酚的合成路线见图1。

图1 3-(3,5-二甲氧基苯乙烯基)苯酚的合成路线Fig.1 Synthetic route of 3-(3,5-dimethoxystyryl)phenol

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

MCF-7细胞、PC-3细胞、HeLa细胞、HepG2细胞。

3-甲氧基苄基磷酸二乙酯、3,5-二甲氧基苯甲醛、甲醇钠、三溴化硼(BBr3)、18/6 冠醚、N,N-二甲基甲酰胺(DMF),北京百灵威科技有限公司;其它试剂均为市售分析纯;柱层析硅胶(200~300目),青岛海洋化工厂;CCK-8试剂盒,市售。

AV400型核磁共振波谱仪(CDCl3为溶剂,TMS为内标),德国Bruker公司;EUROSTAR20型搅拌机,艾卡仪器设备有限公司;SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵,郑州长城科工贸有限公司;RE-52A型旋转蒸发仪,西安予辉实验仪器有限公司;DZF-6020型真空干燥箱,苏州国飞实验室仪器有限公司;ELx800型酶标仪,美国博腾仪器有限公司。

1.2 合成方法

1.2.1 3-羟基苄基磷酸二乙酯(Ⅱ)的合成

在氩气保护、无水无氧条件下,将3-甲氧基苄基磷酸二乙酯(2.58 g,10.0 mmol)溶于30 mL干燥的二氯甲烷中,将反应液冷却至-20 ℃,再将BBr3(2.8 mL,30.0 mmol)慢慢滴加其中,然后在-20 ℃下继续反应12 h。反应结束后,向反应液中慢慢滴加甲醇(2 mL),淬灭反应,随后将反应液一次性倒入冰水中,有白色沉淀析出,过滤,滤饼真空干燥,然后用乙醇重结晶,得到白色固体化合物Ⅱ2.26 g,收率92.4%。1HNMR(400 MHz,CDCl3),δ:7.07~7.13(m,1H),7.01(d,J=7.6 Hz,1H),6.92(d,J=8.0 Hz,1H),6.82(s,1H),6.08(s,2H),4.15~4.21(m,4H),1.31(s,6H)。

1.2.2 3-(3,5-二甲氧基苯乙烯基)苯酚(Ⅳ)的合成

在氩气保护、无水无氧条件下,将化合物Ⅱ(1.95 g,8.0 mmol)溶于20 mL干燥的DMF中,加入甲醇钠(648 mg,12.0 mmol)和18/6 冠醚(1.06 g,4.0 mmol),在70 ℃下反应1.5 h后,将反应液冷却至室温;再加入3,5-二甲氧基苯甲醛(Ⅲ),加热至120 ℃反应5 h,将反应液冷却至室温;加入150 mL冰水,并用2 mol·L-1稀盐酸调节至pH=3,有白色沉淀析出,过滤,滤饼真空干燥,然后用乙醇重结晶,得到白色固体化合物Ⅳ1.49 g,收率72.8%。1HNMR(400 MHz,CDCl3),δ:7.28(t,J=7.6 Hz,1H),7.11(d,J=7.6 Hz,1H),6.97~7.09(m,3H),6.79~6.81(m,1H),6.70(d,J=2.4 Hz,2H),6.45(t,J=2.4 Hz,1H),3.86(s,6H)。

1.3 抗肿瘤活性测试

取对数生长期的MCF-7、PC-3、HeLa和HepG2细胞用胰酶消化,铺至96孔板中,每孔细胞密度约为1×104个。将细胞在37 ℃、5%CO2的培养箱中孵育12 h,弃去培养液;再加入不同浓度(100、50、25、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0,μmol·L-1)的化合物Ⅳ,继续孵育3 d,弃去培养液;每孔加入CCK-8溶液(20 μL)和培养基(100 μL),继续孵育4 h,然后用酶标仪测定490 nm处吸光度(OD),计算化合物Ⅳ的半数抑制浓度(IC50)值。

2 结果与讨论

2.1 结构表征

3-(3,5-二甲氧基苯乙烯基)苯酚的核磁共振氢谱见图2。

图2 3-(3,5-二甲氧基苯乙烯基)苯酚的核磁共振氢谱Fig.2 1HNMR spectrum of 3-(3,5-dimethoxystyryl)phenol

由图2可知,3-(3,5-二甲氧基苯乙烯基)苯酚含有2个甲氧基,在δ3.86处有一个单峰,对应6个H,是3-(3,5-二甲氧基苯乙烯基)苯酚中两个甲氧基的质子信号;此外,在δ7.28~6.45范围内总共出现9个质子信号,是3-(3,5-二甲氧基苯乙烯基)苯酚中两个苯环及乙烯上9个H的信号。表明,产物3-(3,5-二甲氧基苯乙烯基)苯酚的结构正确。

2.2 脱甲基化反应条件的优化

2.2.1 脱甲基试剂对化合物Ⅱ收率的影响

在第一步反应(脱甲基化)中,脱甲基试剂的种类和反应条件(溶剂、温度)对化合物Ⅱ的收率会有明显影响。考察脱甲基试剂种类及反应条件(溶剂、温度)对化合物Ⅱ收率的影响,结果见表1。

由表1可知,以BBr3为脱甲基试剂、CH2Cl2为溶剂,在-20 ℃下反应时脱甲基的效果最佳,化合物Ⅱ收率达到了92.4%;以乙醇钠或AlCl3为脱甲基试剂时,化合物Ⅱ收率不足30%;以HBr为脱甲基试剂时,没有产物生成;以Al和I2作为脱甲基试剂虽然能够使化合物Ⅱ收率达到88.7%,但是因为I2是一种有毒物质,在实验操作过程中容易引发安全事故。因此,确定最佳的脱甲基试剂为BBr3。

表1 脱甲基试剂种类及反应条件对化合物Ⅱ收率的影响Tab.1 Effect of demethylation reagent and reaction condition on yield of compound Ⅱ

2.2.2 BBr3用量对化合物Ⅱ收率的影响

以BBr3为脱甲基试剂,考察BBr3用量即n(Ⅰ)∶n(BBr3)对化合物Ⅱ收率的影响,结果见表2。

表2 n(Ⅰ)∶n(BBr3)对化合物Ⅱ收率的影响Tab.2 Effect of n(Ⅰ)∶n(BBr3) on yield of compound Ⅱ

由表2可知,当n(Ⅰ)∶n(BBr3)=1∶3时,化合物Ⅱ收率最高;若减少BBr3用量,反应不充分,使得化合物Ⅱ收率降低;若增加BBr3用量,化合物Ⅱ收率没有明显变化。因此,确定最佳的BBr3用量为n(Ⅰ)∶n(BBr3)=1∶3。

2.3 Wittig-Horner反应条件的优化

2.3.1 甲醇钠用量对化合物Ⅳ收率的影响

在Wittig-Horner反应中,甲醇钠作为碱,其用量对化合物Ⅳ收率有影响。考察甲醇钠用量即n(Ⅱ)∶n(甲醇钠)对化合物Ⅳ收率的影响,结果见表3。

表3 n(Ⅱ)∶n(甲醇钠)对化合物Ⅳ收率的影响Tab.3 Effect of n(Ⅱ)∶n(sodium methoxide) on yield of compound Ⅳ

由表3可知,当n(Ⅱ)∶n(甲醇钠)=1∶1.5时,化合物Ⅳ收率最高;若减少甲醇钠用量,化合物Ⅳ收率逐渐降低,这可能是因为,甲醇钠用量较少,造成反应不充分;若增加甲醇钠用量,并没有显著提高化合物Ⅳ收率。考虑到成本,确定最佳的甲醇钠用量为n(Ⅱ)∶n(甲醇钠)=1∶1.5。

2.3.2 反应温度与反应时间对化合物Ⅳ收率的影响(表4)

表4 反应温度与反应时间对化合物Ⅳ收率的影响Tab.4 Effect of reaction temperature and reaction time on yield of compound Ⅳ

由表4可知,当反应温度为120 ℃、反应时间为5 h时,化合物Ⅳ收率最高;改变反应温度或反应时间,化合物Ⅳ收率均降低。因此,确定最佳的反应条件为120 ℃反应5 h。

2.4 抗肿瘤活性

采用CCK-8试剂盒测试化合物Ⅳ对MCF-7、PC-3、HeLa和HepG2细胞的抑制活性,结果见表5。

表5 化合物Ⅳ的抗肿瘤活性(n=3)Tab.5 Antitumor activity of compound Ⅳ(n=3)

由表5可知,化合物Ⅳ对MCF-7、PC-3、HeLa和HepG2细胞均有明显的抑制活性,其中对HeLa细胞的抑制活性最强,其IC50值为(11.80±1.27) μmol·L-1。

3 结论

以3-甲氧基苄基磷酸二乙酯(Ⅰ)为原料,经三溴化硼脱甲基得到中间体3-羟基苄基磷酸二乙酯(Ⅱ),随后中间体Ⅱ在甲醇钠的催化下与3,5-二甲氧基苯甲醛(Ⅲ)发生Wittig-Horner反应,得到目标化合物3-(3,5-二甲氧基苯乙烯基)苯酚(Ⅳ),总收率为67.2%。生物活性测试表明,化合物Ⅳ对肿瘤细胞MCF-7、PC-3、HeLa和HepG2均有明显的抑制活性,尤其是抑制HeLa细胞的IC50值达到了(11.80±1.27) μmol·L-1,表明,化合物Ⅳ可作为抗肿瘤先导物进行更深入的研究。

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