程少波，杨巽喆，邹 丽，吴丹丹, 3，陆佳乐，周永红, 3，张海琴

(1.四川农业大学草业科技学院，四川 成都 611130；2.四川农业大学小麦研究所，四川 成都 611130；3.西南作物基因资源发掘与利用国家重点实验室，四川 成都 611130)

多花黑麦草(LoliummultiflorumLamk.)，又称一年生黑麦草、意大利黑麦草，是禾本科黑麦草属的一种优良冷季型牧草，广泛分布于欧洲、亚洲、非洲和南美洲，具有高质优产、生长迅速、适口性好等特点，是我国南方冬季畜牧业应用的首选牧草之一[1]。多花黑麦草有二倍体(2n=2x=14)和四倍体(2n=4x=28)两种倍性，在自然条件下均为二倍体[2]。二倍体多花黑麦草拥有许多优良的抗逆基因，且干物质含量高，而四倍体多花黑麦草具植株高大、茎杆粗壮、叶量丰富等优异牧草性状，因此目前生产上推广使用的多为四倍体[3]。

干旱是影响植物生长和发育的主要非生物胁迫之一，因此牧草的抗旱性鉴定是选育抗旱品种的关键[4-8]。目前，关于不同干旱胁迫条件下黑麦草的生理生化变化研究已有大量报道。PAN等[9]以邦德和阿德纳两份四倍体多花黑麦草材料进行短期干旱处理，结果表明邦德的抗旱性要强于阿德纳。谢宏伟等[10]对13份不同用途的黑麦草进行干旱处理，筛选出沃土、剑宝、特高、俄勒冈和抗锈王等抗旱性强的一年生黑麦草品种，但顶峰和冬绿等品种抗旱性较弱。赵俊茗等[11]以抗旱性较强的一年生黑麦草特高为材料进行干旱处理，发现外源施加壳聚糖可以缓解干旱对黑麦草的影响。赵春程等[12]以4个多年生黑麦草进行了苗期抗旱性鉴定，表明Pr521的抗旱性强于其他3份材料。石永红等[13]以隶属函数分析法对黑麦草进行了苗期抗旱性评价，表明欧必克的抗旱性最强。上述对多花黑麦草的抗旱性研究多集中在苗期单一方法的评价，并未以主成分分析和加权隶属函数法相结合对多花黑麦草进行萌发期抗旱性综合评价，且商业品种与种质材料的抗旱性差异研究相对较少。为探讨不同倍性多花黑麦草抗旱水平差异，本研究采用不同浓度PEG-6000对来自国外各地区和国内主要引进品种及本课题组多年选育的新品系等23份不同倍性的多花黑麦草进行种子萌发期模拟干旱处理，对其抗旱性进行评价，旨在筛选抗旱性强的多花黑麦草种质，为抗旱性品种的选育提供材料基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

来自世界不同国家的23份(9份四倍体和14份二倍体)多花黑麦草用于抗旱评价，其中包括16份品种(系)，2份野生材料，1份地方品种及4份未知类型材料，材料信息见表1。PI编号材料由美国国家植物种质资源库(National Plant Germplasm System，Pullman，Washington，USA)提供。

表1 供试材料

1.2 试验方法

设置5种不同浓度的PEG溶液(3%，6%，9%，12%，15%)对23份多花黑麦草进行干旱处理。选取籽粒饱满的种子用15%的NaClO消毒5 min，用超纯水冲洗5次，挑选30粒种子放于铺有两层滤纸的培养皿中，将3 ml不同浓度的PEG溶液及蒸馏水(CK)注入培养皿中。每个处理3次重复。将培养皿放于温室(温度为22℃，光照周期 16 h·d-1)中培养8 d，每天补充溶液以维持水势的相对稳定[14]。

1.3 测定指标及方法

每天统计种子的萌发情况，以胚芽长度达到种子长度的一半(约0.5 cm)作为萌发标准。第8天萌发结束后，每个处理挑选出10株长势一致的幼苗用于测定胚根长RL(Root length)和胚芽长SL(Shoot length)，其他指标按照以下公式计算[15-16]：

活力指数(VI)=GI×S

式中，Gt为第t日的发芽数，Dt为相对应的发芽时间，S为胚根长。为消除不同材料之间的差异，用抗旱系数来表示各个指标，如RRL(Relative root length)为胚根长的抗旱系数。

1.4 数据处理及分析

1.4.1 加权隶属函数分析[17-21]

(1)

Xij为不同PEG浓度下的抗旱系数，Xj为平均抗旱系数。ARRL(Average relative root length)为平均相对胚根长，ARSL(Average relative shoot length)为平均相对胚芽长，ARGR(Average relative germination rate)为平均相对发芽率，ARGE(Average relative germination energy)为平均相对发芽势，ARGI(Average relative germination index)为平均相对发芽指数，ARVI(Average relative vigor index)为平均相对活力指数。

F(Xj)=a1j·X1j+a2j·X2j+…

+aij·Xkj(k=1,2,…,n)

(2)

F(Xj)为综合指标的得分，aij为特征向量，Xkj为每个指标经标准化处理后的值。

(3)

Wj表示第j个综合指标的权重，Pj为主成分分析后第j个指标的综合贡献率。

(4)

μ为综合指标的隶属函数值，Xmin为第i个综合指标的最小值，Xmax为第i个综合指标的最大值。

(5)

D值为不同品种多花黑麦草的抗旱能力综合评价值。

1.4.2 数据处理 数据用EXCEL整理分析，利用SPSS 26.0进行相关性分析、主成分分析和聚类分析，Origin 2019b进行绘图，TBtools进行热图绘制。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫对不同倍性多花黑麦草根长和芽长的影响

干旱胁迫下不同倍性多花黑麦草的根长和芽长见图1。从根长来看，二倍体和四倍体在6%PEG处理时与对照(CK)差异显著，并出现显著下降；随着PEG处理浓度(9%、12%和15%)的提高，根长都出现显著下降(P<0.05)，且四倍体的根长都明显高于二倍体，表明四倍体抗旱能力优于二倍体(图1a)。然而，3% PEG处理时四倍体根长较对照表现出轻微的上升趋势，但差异不显著，表明低浓度的PEG处理可以促进多花黑麦草根的生长(图1a)。

从芽长看，二倍体和四倍体在6% PEG处理时比对照出现显著下降(P<0.05)，随着处理浓度的提高芽长出现显著下降，且平均芽长都低于四倍体，表明二倍体比四倍体对干旱更敏感(图1b)。

注：不同小写字母表示处理浓度和倍性间差异显著(P<0.05)。

2.2 干旱胁迫下多花黑麦草各指标相对值和平均抗旱系数

在3%和6%PEG处理下，23份多花黑麦草材料的相对胚根长、相对胚芽长、相对发芽率、相对发芽势、相对发芽指数和相对活力指数6项指标都保持较高的水平。随着PEG浓度的提高，对多花黑麦草生长的抑制变得更加明显，在9%、12%和15% PEG处理下，6项指标之间都存在极显著差异(P<0.01)(图2a～图2f)。

从相对胚根长看，在PEG胁迫下，四倍体多花黑麦草的相对胚根长普遍高于二倍体材料，其中在15% PEG处理下，PI 343155的相对胚根长最高，为0.509，其次是川饲1号，相对胚根长为0.423(图2a)。在干旱胁迫下，植物会通过根的生长来吸收更多的水分和养分，而四倍体材料在不同浓度处理下都表现出较高的胚根长，表明四倍体材料更有利于应对干旱胁迫。

相对胚芽长也表现出相应的趋势，在15% PEG处理下，四倍体材料PI 343155、特高和PI 619469表现出较高的胚芽长，表明干旱胁迫对其影响较低(图2b)。

四倍体材料PI 343155、PI 619469和川农1号在15% PEG处理下的相对发芽势、相对发芽指数和相对活力指数最大，表明其种子活力较高(图2d～图2f)。

图2 23份多花黑麦草萌发期生长指标相对值

从各指标平均相对值来看，在干旱胁迫下，四倍体多花黑麦草的各指标平均值均高于二倍体多花黑麦草(表2)。四倍体中，929-3的平均相对胚根长和平均相对发芽势的值最高，为0.785和 0.756；PI 343155的平均相对胚芽长和平均相对活力指数最高，为0.858和0.608；PI 619469的平均相对发芽率和平均相对发芽指数最高，为0.888和0.756。平均相对胚根长和平均相对发芽率最低的是品种剑宝，为0.624和0.623；达伯瑞的平均相对胚芽长、平均相对发芽势和平均相对发芽指数最低，分别为0.600、0.443和0.534；川饲1号的平均相对活力指数最低为0.403(表2)。以上结果表明：在四倍体材料中，929-3、PI 343155和PI 619469的抗旱性相对较高，而剑宝和达伯瑞的抗旱性相对较低。

表2 23份多花黑麦草的平均抗旱系数

二倍体材料中，PI 634251的平均相对胚根长最高，为0.683；PI 619471的平均相对胚芽长和平均相对活力指数最高，为0.744和0.522；PI 255172的平均相对发芽率最高，为0.826；W69271的平均相对发芽势最高，为0.809；PI 283610的平均相对发芽指数最高，为0.760。PI 619473的平均相对胚根长和平均相对发芽势最低，为0.466和0.447；PI 517948的平均相对发芽率、平均相对发芽指数最低，为0.584和0.484；平均相对胚芽长和平均相对活力指数最低的材料分别为PI 478508和PI 648355，为0.596和0.365。以上结果表明：在二倍体材料中，PI 255172、PI 283610、PI 619471、PI 634251和W69271的抗旱性相对较高，而PI 478508、PI 517948、PI 619473和PI 648355的抗旱性相对较弱。

2.3 干旱胁迫下多花黑麦草萌发期各项指标的相关性分析

对用于抗旱性评价的6项幼苗生长指标进行相关性分析，结果表明：在四倍体多花黑麦草中，除了平均相对胚根长与平均相对胚芽长，平均相对发芽率、平均相对发芽势和平均相对发芽指数，平均相对胚芽长与平均相对发芽率未相关外，其余指标之间都呈现显著或极显著相关性，其中，平均相对活力指数与平均相对胚芽长的相关性最高(R=0.912，P<0.01)。6个萌发期指标与D值呈极显著正相关，相关程度依次为平均相对活力指数、平均相对胚芽长、平均相对发芽势、平均相对发芽指数、平均相对发芽率和平均相对胚根长(表3)。

二倍体多花黑麦草的平均相对胚芽长与平均相对发芽势和平均相对发芽指数分别达到显著(R=0.599，P<0.05)和极显著水平(R=0.673，P<0.01)，平均相对发芽势与平均相对活力指数和平均相对发芽指数达到显著和极显著水平(R=0.653，P<0.05；R=0.716，P<0.01)，平均相对发芽指数与平均相对活力指数达到极显著水平(R=0.687，P<0.01)。除平均相对发芽率未与D值相关外，其余5个指标均与D值显著或极显著相关，表明这些指标可以作为多花黑麦草萌发期抗旱性初步筛选的指标(表3)。

表3 二倍体和四倍体材料的抗旱指标相关性分析

2.4 干旱胁迫下多花黑麦草萌发期抗旱性的主成分分析

主成分分析可将多个指标转化为几个独立的指标，从而反映原来多指标的信息。将6个指标抗旱系数进行主成分分析后，得到两个主成分(PC1和PC2，见表4)。第一主成分的特征根为3.944，贡献率为65.73%，芽长、发芽势、发芽指数和活力指数有较高的载荷，反映了多花黑麦草的萌发情况，所以第一主成分可归纳为“萌发因子”；第二主成分特征根为0.888，贡献率为14.80%，根长有较高的载荷(0.743)，反映了黑麦草的根部生长状况，可概括为“根部生长因子”。

表4 23份多花黑麦草萌发期抗旱性主成分分析

因子载荷值除以该成分的特征根的平方根得到特征向量，将6个指标的平均抗旱系数进行数据标准化后，以公式(2)可得到两个主成分的综合指标值(F1和F2)。

F1=0.647ARRL+0.918ARSL+0.661ARGR+0.815ARGE+0.852ARGI+0.924ARVI

F2=0.743ARRL+0.034ARSL-0.032ARGR-0.319ARGE-0.451ARGI+0.166ARVI

根据公式(3)和(4)得到的权重系数与隶属函数值μ，再按照公式(5)得到D值，即抗旱能力综合评价值(表5)。结果显示D值的变化范围为0.117～0.946，由D值排序可知，四倍体材料PI 343155抗旱性最强，二倍体材料PI 238886抗旱性最弱(表5)。

表5 23份多花黑麦草的D值

2.5 聚类分析

采用欧式距离法对23份多花黑麦草的抗旱能力综合评价值(D值)进行系统聚类分析。结果表明：在欧式距离3.8处，23份材料可以分为4大类。第I类为PI 343155、PI 619469、929-3、川农1号、特高5份四倍体抗旱材料；第II类全部为二倍体材料，共5份，即PI 266111、PI 283610、PI 619471、PI 634251和W69271；第III类为PI 272119等9份中等抗旱材料；第IV类全部为二倍体材料，包括PI 238886等4份二倍体干旱敏感材料(图3)。

图3 23份多花黑麦草D值的聚类分析

3 讨论与结论

3.1 多花黑麦草萌发期抗旱性鉴定

植物的抗旱性是由多个因子控制的数量性状，不同材料对某一指标的抗旱性反应不一定相同，因此用单一指标评价抗旱性不能全面反映其抗旱能力[22-24]。萌发期抗旱性评价指标包括根长、芽长、发芽率和胚根鞘长等[14, 25]。张海平等[26]以6项萌发指标对568份大豆进行了萌发期耐旱种质筛选，筛选出4份耐旱种质和18份较耐旱种质。郝俊峰等[18]以本研究的6项指标对11份苜蓿材料进行萌发期抗旱性评价，筛选出农菁8号等萌发期抗旱性材料。

根长和芽长作为干旱胁迫响应的基本参数，是衡量植物抗旱能力的两个重要指标。本研究中，在3% PEG处理下，部分四倍体多花黑麦草的胚根长如PI 343155、剑宝、特高、邦德和929-3较对照处理表现出上升的趋势，而二倍体材料的胚根长均低于对照；四倍体材料PI 343155、剑宝和邦德的胚芽长和对照相比表现出上升的趋势，而二倍体材料同样均低于对照。但随着PEG浓度的不断升高，各项指标都开始表现出下降趋势，说明高浓度的PEG抑制了多花黑麦草的生长。在12% PEG处理下，所有材料的根均可生长，而在15% PEG处理下，部分二倍体材料如PI 238886的根表现出停止生长的趋势，表明12%～15% PEG可作为多花黑麦草萌发期抗旱材料筛选的合适浓度。相关性分析也表明，四倍体全部指标、二倍体除相对发芽率指标外都与D值显著或极显著相关，表明这些指标可以作为综合反映多花黑麦草萌发期抗旱性的首选指标。

PAN等[9]、ZHAO等[11]和谢宏伟等[10]的研究表明邦德、剑宝和特高都是抗旱品种，在本研究的12% PEG和15% PEG高浓度处理下，以上3个品种也表现出较高的相对胚根长，表明它们为抗旱性较强的品种。同时，本研究中，在12% PEG处理下，川饲1号和剑宝的相对胚根长相近，而在15% PEG处理下，川饲1号的相对胚根长高于邦德、剑宝和特高，说明川饲1号也是相对抗旱的材料。

3.2 不同倍性多花黑麦草的抗旱性比较

多倍体作为一种重要的遗传和育种资源，具有更强的抗逆性。目前已在柳枝稷[27]、大麦[28]、柑橘[29]等植物中研究其多倍体的耐旱性，但关于不同倍性多花黑麦草抗旱性的研究相对较少。本研究中，在不同浓度处理下，四倍体多花黑麦草的根长和芽长均显著高于二倍体，表明四倍体多花黑麦草相比二倍体多花黑麦草在干旱胁迫下更能适应干旱环境。同时，本研究中部分四倍体多花黑麦草的D值低于二倍体，表明其抗旱能力低于部分二倍体材料。

在干旱胁迫下，四倍体材料所有指标的平均相对值均高于二倍体材料，其中四倍体材料的平均相对胚根长和平均相对活力指数均显著高于二倍体材料(P=0.00<0.05；P=0.01<0.05)，其余4项指标差异不显著。说明在干旱胁迫下，二倍体材料在根长和活力指数这两个指标上相对于四倍体材料更加敏感。

23份不同倍性多花黑麦草通过测定6项萌发指标并结合隶属函数分析、主成分分析和聚类分析进行萌发期抗旱性初步鉴定，筛选出PI 343155、PI 619469、929-3、川农1号和特高等5份四倍体和PI 266111、PI 283610、PI 619471、PI634251和W69271等5份二倍体抗旱性较强的材料。这些材料大部分为育成品种(系)和野生材料，经过长期的自然选择和人工选择，能够适应干旱环境。但萌发期的抗旱性并不能代表全生育期的抗旱性，这些萌发期抗旱性强的多花黑麦草需通过苗期和成株期鉴定，以进一步确定其苗期和成株期抗旱能力。

致谢：感谢美国国家植物种质资源库(American National Plant Germplasm System，Pullman，Washington，USA)及四川农业大学草业科技学院马啸教授提供部分研究材料。