张朝阳 刘秀华 王 悦 曲亚通 杨晓娟 刘贵巧 翁 瑞

（1.河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北 邯郸056038； 2.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量安全重点实验室，北京 100081； 3.中国农业科学院烟草研究所，农业农村部烟草质量安全风险评估实验室，青岛 266101）

新烟碱类杀虫剂是一类神经活性农药，广泛应用于果蔬、 茶叶、 小麦等农作物种植过程中，其作用于昆虫神经系统突触后膜的烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR） 和周围神经，使昆虫保持兴奋、 麻痹直至死亡，主要用于防治刺吸式口器害虫，对水生及陆生无脊椎动物具有致死作用[1～3]。 目前，新烟碱类农药已发展到第3 代，是农业领域内使用量最广泛的杀虫剂之一，但大量使用及不合理施用等行为使其残留于农产品及土地、 水源等自然生态环境中。 CHEN 等[4]以我国第5 次 （2009－2012年） 总膳食研究和第6 次 （2015－2018年） 总膳食研究的膳食样本为基础，测定24 个省份528 份膳食样本中10 余种新烟碱类农药的残留情况，发现检出率最高的均为吡虫啉（61.8%）和啶虫脒（56.9%）。谭颖等[5]对北京市场上49 种蔬菜和24 种水果进行新烟碱类农药检测，发现吡虫啉和啶虫脒的检出率均达到100%。 CRADDOCK 等[6]对美国2004－2011年间水样中新烟碱类农药残留趋势分析发现，未处理水中吡虫啉检出率由2%上升到36.7%，饮用水中吡虫啉检出率由小于1%上升到29.7%。 由此可见，吡虫啉和啶虫脒在食品和环境中的残留较高，残留的农药随食物链、 呼吸等方式进入生物体内代谢转化从而影响健康。

目前我国关于新烟碱类农药的研究多集中在食品检测、 农药合成以及对生物多样性和环境的影响等方面[7～9]，对其在生物体内代谢转化的研究较少。而国外在新烟碱类农药生物转化方面起步较早，已揭示了部分新烟碱类农药的代谢方式、 药代动力学等信息[10～11]，但因物种之间存在差异，吡虫啉在人体内的代谢产物和具体的代谢途径并不明确。 人肝微粒体体外温孵法可以较好地模拟人体内的代谢过程，在国内外多应用于医药学领域的研究[12～14]，其中含有的细胞色素P450（Cytochrome P450，CYP450）酶是代谢的重要酶系，在生物转化过程中发挥着重要作用[15～17]。 该模型无需消耗大量实验动物，可大量开展实验且操作简单，避免了生物体内复杂环境的干扰，实验结果更易观察。 明确的药物代谢途径、 代谢产物活性对了解药物毒性、 制定合理治疗方案及新药开发都具有重要的指导意义[18]。 因此，本研究选取吡虫啉（C9H10ClN5O2） 为农药底物，采用人肝微粒体体外孵育模型，利用超高效液相色谱串联四极杆－静电场轨道阱高分辨质谱（UHPLCQ ExactiveTMPlus Orbitrap MS） 技术检测其在人肝微粒体中的代谢产物，并结合二级质谱信息推测其代谢途径，期望为揭示吡虫啉等新烟碱类杀虫剂在人体中的代谢途径提供理论依据。

一、 材料与方法

（一） 主要实验仪器Ultimate 3000 液相色谱仪，配备有Q ExactiveTMPlus 四极杆－静电场轨道阱高分辨质谱 （美国Thermo Fisher 公司，配有电喷雾离子源及Xcalibur 数据处理系统）； HH－S 数显恒温水浴锅 （常州翔天实验仪器厂）； ST16R 高速冷冻离心机 （美国Thermo Fisher 公司）； IKA VORTEX 3 漩涡混匀器 （德国IKA 公司）； Milli－Q ACADEMIC 超纯水纯化系统 （法国MILLIQ 公司）； XSE105 分析天平 （美国Mettler Toledo 公司）； 小型制冰机（北京天林恒泰科技有限公司）。

（二） 材料与试剂吡虫啉标准品 （纯度≥99.8%，天津阿尔塔科技有限公司）； 乙腈、 甲酸铵 （质谱级，美国Thermo Fisher 公司）；甲酸[质谱级，霍尼韦尔贸易（上海）有限公司]； NADPH 再生系统（美国Sigma－Aldrich 公司）； Tris－HCl 缓冲液（1mmol/L，pH 7.4，北京索莱宝科技有限公司）；男性人肝微粒体购自武汉普莱特生物医药技术有限公司，收到后溶解并分装，存于－80℃冰箱。

（三） 实验条件

1.色谱条件。 色谱柱使用Agilent Poroshell 120 EC－C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm），带有保护柱。 流动相A 相为5 mmol/L 甲酸铵－0.1%甲酸水溶液，B 相为5 mmol/L 甲酸铵－0.1%甲酸乙腈。梯度洗脱程序：0～2min，5%B； 2～7min，30%B；7～12 min，100%B； 12～16 min，100%B； 最后回到初始流动相条件平衡柱子4 min。 柱温：25℃，流速0.4 mL/min，进样量5 μL。

2.质谱条件。 电喷雾离子源 （ESI） 正离子模式，鞘气流速40 L/h，辅助气流速10 L/h，喷雾电压3.8 kV，毛细管温度325℃，加热温度400℃，S－Lens RF 电压60 V，采集范围m/z50 ～750。 归一化碰撞能量 （NCE）：低能量为10%； 中能量为35%； 高能量为55%。 仪器使用中的气体均为高纯度氮气，采用Full MS/dd－MS2的数据采集模式。

（四） 人肝微粒体孵育将吡虫啉标准品溶解于乙腈中，配制成浓度为10 mg/mL 的溶液备用。配制终体积为200 μL 的NADPH 再生系统，其中包括人肝微粒体（终浓度为1 mg/mL）、 NADPH 溶液 （终浓度为1.5 mmol/L）、 Tris－HCl 缓冲液 （纯水稀释到0.05 mol/L）。 上述混合溶液在37℃水浴锅中预孵育2 min，随后加入1 μL 配制好的吡虫啉标准溶液，在37℃的水浴锅中孵育4 h，最后向孵育体系中加入等体积的预冷乙腈（200 μL） 终止反应，在4℃下以14000 r/min 离心15 min，转移上清液至进样小瓶上机检测。 实验过程中同时设置3个对照组，分别为无人肝微粒体组、 无NADPH 组和无底物组，以相同方法进行孵育，具体孵育体系分组见表1。

表1 吡虫啉人肝微粒体代谢孵育体系 （μL）

二、 结果与讨论

（一） 吡虫啉的质谱分析吡虫啉的保留时间为7.16 min，在正离子模式下，准分子离子峰[M+H]+质量数为256.0592。 在ESI 离子源作用下，吡虫啉经碰撞能诱导解离后产生的主要离子碎片有m/z209.0586、 175.0976 、 128.0261 和84.0561。 其中，m/z为209.0586 的碎片离子是断裂丢失一个NO2和两个氢离子形成的； 裂解产生的碎片离子m/z175.0976 比碎片离子m/z209.0586 小34，推测是碎片离子m/z209.0586 断裂丢失一个氯原子后形成的； 碎片离子m/z128.0261 和84.0561 是碎片离子m/z209.0586 碳氮键断裂形成的两个碎片，碎片离子m/z175.0976 断裂相同位置的碳氮键也会形成碎片离子m/z84.0561，因此碎片离子m/z84.0561 强度高于碎片离子m/z128.0261，详细的裂解路径见图1。

图1 吡虫啉的质谱裂解路径

（二） 代谢产物鉴定将人肝微粒体孵育后的实验组和对照组溶液在UHPLC－Q ExactiveTMPlus Orbitrap MS 仪器上机进样检测，对比两组谱图，并结合吡虫啉的碎片信息和质谱裂解路径图对代谢产物进行分析，从实验组的总离子流图中筛选并鉴定出吡虫啉原型化合物和5 个代谢产物 （M1～M5）。 吡虫啉及其代谢产物（M1～M5）对应的提取离子流色谱图、 二级质谱图分别见图2、 图3，代谢产物信息见表2。

表2 吡虫啉经人肝微粒体体外孵育的代谢产物信息

图2 吡虫啉及其代谢产物（M1～M5） 的提取离子流色谱图

图3 吡虫啉及代谢产物（M1～M5）的二级质谱图

代谢产物M1 的准分子离子峰[M+H]+的m/z为272.0538，与吡虫啉的准分子离子峰[M+H]+256.0592 相比增大了16 u，并且产生的二级碎片离子225.0535、 191.0925 与吡虫啉二级碎片离子209.0586、 175.0976 分别相差16 u，存在相同碎片离子84.0561。 因此，推测代谢产物M1 为吡虫啉加一个羟基形成，分子式为C9H10ClN5O3，理论[M+H]+m/z值为272.0545，与检测值的误差为－2.57×10－6，保留时间为6.40 min。

代谢产物M2 的准分子离子峰为[M+H]+的m/z为211.0741，与吡虫啉的准分子离子峰[M+H]+256.0592 相比小了45 u，且产生的二级碎片离子175.0981、 128.0079、 84.0563 与吡虫啉二级碎片离子值几乎相同。 因此，推测代谢产物M2 为吡虫啉脱硝基形成，在脱硝基后在原位置连接一个氢原子，推测分子式为C9H11ClN4，理论[M+H]+m/z值为211.0745，与检测值的误差为－1.90×10－6，保留时间为4.09 min。

代谢产物M3 的准分子离子峰为[M+H]+的m/z为240.0641，与吡虫啉的准分子离子峰[M+H]+256.0592 相比小了16 u，且产生的二级碎片离子209.0591、 175.0981、 128.0264、 84.0563 与吡虫啉二级碎片离子值几乎相同。 因此，推测代谢产物M3 为吡虫啉硝基掉一个氧原子后形成亚硝基产生的，推测分子式为C9H10N5OCl，理论[M+H]+m/z值为240.0647，与检测值的误差为－2.50×10－6，保留时间为5.90 min。

代谢产物M4 的准分子离子峰为[M+H]+的m/z为254.0433，与吡虫啉的准分子离子峰[M+H]+256.0592 相比小了2 u，推测是掉两个氢原子后形成，产生的二级碎片离子与吡虫啉的二级碎片离子不同，但二级碎片离子126.0108 与代谢产物M3中二级碎片离子值几乎相同，推测代谢产物M4 的质谱裂解路径与吡虫啉裂解路径不同。 代谢产物M4 的分子式推测为C9H8ClN5O2，理论[M+H]+m/z值与检测值的误差为－2.36×10－6，保留时间为6.11 min。

代谢产物M5 的准分子离子峰为[M+H]+的m/z为158.0000，与吡虫啉的准分子离子峰[M+H]+256.0592 相比小了98 u，推测为吡虫啉碳氮键断裂后甲基氧化为羧基形成。 因此，推测代谢产物M5的分子式为C6H4ClNO2，理论[M+H]+m/z值与检测值的误差为－1.90×10－6，保留时间为6.36 min。

（三） 代谢路径分析吡虫啉经过人肝微粒体体外代谢孵育共得到5 种代谢产物，代谢产物M1～M3 分别推测为吡虫啉－羟基、 脱硝基吡虫啉和亚硝胺吡虫啉。 其中吡虫啉－羟基在人、 鼠、猫、 狗肝微粒体中均有发现[19]，脱硝基吡虫啉、 亚硝胺吡虫啉在人肝微粒体中有发现[20]，涉及的主要代谢途径有羟基化、 脱硝基以及亚硝基化，在本研究中根据得到的一级离子质荷比和二级碎片离子信息确定了3 种代谢产物结构，并推断了3 种代谢产物的代谢路径（见图4）。 代谢产物M4 推断为吡虫啉－烯烃，代谢产物M5 推断为6－氯烟酸，涉及的主要是烯烃化和氧化反应，这两种代谢产物在之前的肝微粒体体外孵育实验中并未发现和检出，根据检测得到的谱图信息确定了其代谢路径（见图4）。本研究得到的5 种代谢产物中M5 转化率最低，代谢产物M1、 M3 转化率最高，因此代谢产物M1、M3 可以作为吡虫啉监测实验中的代谢标志物。

图4 吡虫啉经人肝微粒体体外孵育的代谢路径

三、 结论

本研究通过男性人肝微粒体体外孵育体系对吡虫啉进行孵育，利用UHPLC－Q ExactiveTMPlus Orbitrap MS 技术对代谢产物进行鉴定，得到了代谢产物的保留时间、 一级离子质荷比、 二级碎片离子等信息，共鉴定出5 种吡虫啉代谢产物，主要涉及加羟基、 脱硝基、 还原、 氧化等代谢反应，初步阐明了吡虫啉的I 相代谢途径，该结果可为研究吡虫啉中毒后治疗以及研发新药提供思路和数据参考。