吕国达 魏俏红 康炜鹏 徐士磊 胡菡│文

1 农业农村部蜂产品质量监督检验测试中心（北京） 中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100193；2 蜜蜂饲养与蜜蜂生物学创新团队 中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100193；3 辽宁省农业发展服务中心，兴城 125100

前言

蜂王浆（Royal Jelly）又名蜂皇浆，是蜂群中哺育蜂咽下腺和上颚腺分泌的一种乳白色或淡黄色的浆状物质，主要用于饲喂1～3日龄幼虫和蜂王[1-2]。作为天然的功能性食品，蜂王浆具有免疫调节、抗衰老、抗氧化、抗菌消炎、抗糖尿病、降血脂、抗高血压、抗肿瘤等生物学功能，而深受人们的青睐[3-5]。蜂王浆的这些功能来自于其丰富的活性成分，其中含水量约为60%～70%，蛋白质9%～18%，糖类7%～18%，脂质3%～8%，矿物质0.8%～3%，还含有维生素、酚类和氨基酸等物质[6-7]。

蜂王浆作为一种功能性食品，深受广大消费者的喜爱。但在生产、储存和运输投放到市场的过程中，难免会因为存放条件的不合适而导致蜂王浆质量下降，有效活性的丧失[8]。因此，蜂王浆新鲜度也是其品质的重要指标[9]。蜂王浆特有的一种活性物质，10-羟基-2-癸烯酸又称王浆酸（10-HDA），含量为1.4%～2.0%[6-7]，在国际和行业中通常用来评价蜂王浆的质量。由于其在高温环境中也非常稳定，尽管能够在一定程度上反映蜂王浆的质量，但不能够代表蜂王浆的新鲜度[9-10]。

蛋白质作为蜂王浆中含量最高的一类活性物质，是蜂王浆功能的重要体现[11-12]，会随着储存温度升高和时间的延长发生显著变化[13-14]。蜂王浆蛋白质主要包括水溶性蛋白和非水溶性蛋白，其中水溶性蛋白约占蛋白总量的46%～89%[15]。蜂王浆主蛋白家族（Major Royal Jelly Proteins，MRJPs）占蜂王浆可溶性蛋白质含量的 80%以上[16-17]，其中，MRJPl、MRJP2、MRJP3、MRJP4 和MRJP5约占MRJPs总量的82%～90%[18]。研究表明，MRJP3～5在蜂王浆中含量相对较低，且对储存温度敏感[13]。我们通过对蜂王浆抗菌性和可溶性蛋白质溶液的活性检测，评价了不同储存条件对蜂王浆中多种蛋白质含量的影响，发现蜂王浆中MRJP4含量随储存温度的升高和时间的延迟而降低，且其含量在一定程度上能够表征蜂王浆的新鲜度，因此，选取MRJP4作为蜂王浆新鲜度的标志物[9]。

为了考察我国蜂王浆生产的整体质量水平，以及可溶性蛋白质MRJP4含量作为蜂王浆新鲜度评价指标的可行性，本研究采集来自全国14个省市的不同蜜粉源的151个新鲜蜂王浆样品，参考国家标准《蜂王浆》GB 9697-2008检测蜂王浆样品中的水分含量，采用液相色谱质谱联用方法检测10-HDA含量，考马斯亮蓝染色法测定可溶性蛋白质浓度，以及夹心ELISA法测定MRJP4含量。通过对比不同地区不同蜜粉源生产蜂王浆的各项指标，探讨导致蜂王浆理化指标不同的原因，以及对蜂王浆MRJP4含量的影响。本研究基于现有蜂王浆质量标准的基础，为制定蜂王浆新鲜度评价指标提供理论依据，这将对我国蜂王浆产业实行优质优价的可持续发展具有重要意义。

2 材料与方法

2.1 蜂王浆样品采集

2020年的3～8月间，共采自全国14个省市（图1）不同蜜粉源的新鲜蜂王浆样品151个。这14个省市划分为：东北及华北地区，包括黑龙江省、辽宁省、吉林省和北京市；西北地区包括青海省和新疆维吾尔自治区；华中及西南地区包括河南省、湖北省和重庆市；东南部地区包括安徽省、福建省、江苏省、江西省和浙江省；各地区分别采集新鲜蜂王浆样品50、40、22和41个，详细信息见表1。除个别样品外，每个蜂场或者生产者采集新鲜蜂王浆样品2管，每管大于30 g，取样后立刻冻存，放置-20℃保存待测，存放1个月内进行各项指标的检测。

图1 蜂王浆采样地区分布图

表1 蜂王浆样品信息

2.2 水分含量的测定

蜂王浆中水分含量测定参考《蜂王浆》国家标准（GB 9697-2008）。精密称量1 g蜂王浆样品于干燥至恒量的称量皿中，放入减压干燥箱，在75℃，压力-0.095～-0.10 MPa下干燥4 h，冷却30 min后称量，反复干燥直至前后两次质量差不超过2 mg为恒量。每个样品重复两次。

2.3 10-羟基-2-癸烯酸含量的测定

蜂王浆中10-HDA含量测定采用液相色谱质谱联用技术测定（LC-MS/MS, Thermo QE，美国）[9]。采用正离子模式，挑选10-HDA 的特征离子187.13287 m/z进行碎裂，对MS/MS的特征碎片81.07 m/Z峰面积进行定量，计算10-HDA的含量。每个样品三个重复。

2.4 水溶性蛋白含量的测定

采用考马斯亮蓝法（G250）测定蜂王浆中可溶性蛋白质的含量。取1 g 蜂王浆加蒸馏水充分溶解至20 ml水溶液，4℃超声10 min，取2 ml样品，4℃，12,000 rpm离心20 min，取上清为蜂王浆蛋白提取液（S液）；此提取液再稀释20倍，595 nm波长下，酶标仪测量吸光值。标准曲线范围为0.05～0.3 ng/μl。每个样品三个重复。

2.5 MRJP4含量的测定

将2.4制得S液再依次稀释50倍和10倍，一共稀释10000倍。根据MRJP4试剂盒说明，用全波长酶标仪在450 nm波长，测量各样品的光密度，并计算MRJP4的含量。每个样品三个重复。

2.6 统计分析

用单样本Kolmogorov-Smi rnov检验对151种蜂王浆理化性质的数据进行分析，并确定为正态分布。本文中蜂王浆理化指标均采用软件SPSS 26.0的单因素方差分析（ANOVA）进行统计数据分析。

3 结果与讨论

3.1 总体指标分析

2020年3 月至2020年8月期间，在我国14个省市，收集了不同蜜粉源植物的蜂王浆样品，共计151个。按照样品采集地区划分为东北地区（三个天气较为寒冷的省份）、西北地区(平均海拔高于海平面，寒冷且干燥)、东南地区（低海拔省份，天气温和且降雨量较多）和中部地区（天气较为干燥）。按照不同蜜粉源植物来划分，将多于5个蜂场的同一蜜粉源植物为一个分类，其他均归为百花蜜粉源，主要采集了油菜、洋槐、茶花、椴树、橘子花期和百花蜜粉源的蜂王浆样品。

采集的151个蜂王浆样品的水分、10-HDA含量、可溶性蛋白质含量和MRJP4含量的平均值分别为62.04%、1.72%、11.99 g/100g和447.38 μg/100g蜂王浆（表2）。世界其他国家也开展了蜂王浆生产的研究。伊朗三个不同地区代表性气候的生产的蜂王浆样品，蜂王浆总蛋白含量为11.5%～14.5%，10-HDA含量为0.676%～ 2.443%[19]。欧洲采自摩洛哥、葡萄牙和西班牙的6个蜂王浆样品，它们的总酚含量在3～9 mg/g蜂王浆，黄铜/黄酮醇含量为0.1～0.5 mg/g蜂王浆，10-HDA含量为0.9%～1.2%，总蛋白含量为5.5%～29.7%[20]。由此比较可见，我国蜂王浆整体质量水平较高，在生产上并未因为产量的提高而降低品质。

表2 蜂王浆的理化指标结果 (mean±sem)

按照国家标准GB9697-2008要求进行划分，采集的151个蜂王浆样品的水分含量均达到优等品标准（含水≤67.5%）。而10-HDA的含量均值为1.72%；151个蜂王浆样品中优等品（含量>1.8%）60个，占总数量的39.74%；合格品（1.4%～1.8%）65个，占总数量的43.05%。就这两项来说，本研究采集的我国大部分蜂王浆产品质量较好。

蜂王浆中10-HDA含量一直是蜂王浆生产实验中衡量蜂王浆质量的一项重要指标。在以往的研究中，在浙江省开展的两项研究中，实验分别测得蜂王浆样品中10-HDA含量在1.27%～1.44%和1.82%～2.10%[21]。而在云南省西方蜜蜂蜂王浆中10-HDA含量为2.33%～2.43%[22]。本研究中151个蜂王浆样品中10-HDA含量分布在0.98%～3.57%，测定值分布范围宽主要是由于采集样品的范围较广，地域、蜜粉源植物和生产管理模式都是影响因素。

MRJP4作为一项新的检测指标提出用于评价蜂王浆的新鲜度[9,23]。因此，本研究采集了不同地区、不同蜜粉源和不同蜂种生产的蜂王浆来考察我国蜂王浆中MRJP4含量的范围，为今后将MRJP4作为蜂王浆新鲜度评价指标提供理论基础。在151个样品中，以本实验操作进行检测，MRJP4的最低含量为24.73 μg/100g，低于100 μg/100g的样品一共有17个（占11.3%）；含量在100～500 μg/100g的样品有78个（占51.7%）；含量在500～1000 μg/100g的样品有33个（占21.9%），超出1000 μg/100g检出限的样品有23个（占15.2%），因此，含量在500 μg/100g以上的样品占了37.1%。这151个蜂王浆样品中MRJP4含量测定值范围包含了2016年和2017年在北京蜂场生产的新鲜蜂王浆实验检测值（约0.2 mg/100g）[24]。

（未完待续）